钾素营养对当归阿魏酸生物合成相关基因表达的影响-中药学专业论文.docxVIP

钾素营养对当归阿魏酸生物合成相关基因表达的影响 钾素营养对当归阿魏酸生物合成相关基因表达的影响 PAGE PAGE 1 摘 要 目的：当归为临床常用药，阿魏酸是鉴别当归质量优劣的主要指示性指标之 一。钾素是植物体内 60 多种酶的活化剂，钾素的适量施用对作物的生长、产量 及品质等均有积极影响。多年来，国内外关于当归资源评价、生理特性、栽培育 种、药理药化以及活性成分的分离提取等方面的研究已有大量报道，但基于与活 性成分合成相关的功能基因的分子生物学和营养调控的研究，国内外还鲜有报 道。本研究旨在通过对当归阿魏酸生物合成中重要基因咖啡酸-O-甲基转移酶基 因(COMT)、4-香豆酸辅酶 A 连接酶基因(4CL)和阿魏酸-5-羟基化酶基因(F5H)的 克隆和表达进行初步分析，并进行钾素营养调控，为探索当归阿魏酸生物合成途 径的分子机制和营养调控效应奠定基础，为阐述当归品质形成的营养调控机制提 供理论依据。 方法：参考 Genbank 已发表的植物 COMT、4CL、F5H 基因保守序列设计一 对简并引物，以当归叶片总 RNA 为模板，采用反转录 PCR(RT-PCR)法克隆出 COMT、4CL 和 F5H 基因核心片段后测序；以核心片段序列设计基因特异性引 物，利用 cDNA 末端快速扩增(RACE)法克隆出 COMT 和 F5H 基因两翼序列； 将核心序列和两翼序列进行电子拼接，设计基因全长扩增引物，扩增出全长 cDNA 序列，并进行测序，在 Genbank 中注册。运用 SYBR Green 荧光定量 PCR 方法，以当归 18S 基因为内参照基因，检测 COMT、4CL 和 F5H 基因在当归不 同组织，不同时期和不同钾素处理中的表达量。 结果：(1)当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长的克隆及序列分析(登 录号: KP188587):利用 RT-PCR 和 RACE 技术，得到了当归咖啡酸-O-甲基转移酶 基因(COMT)全长，该基因 cDNA 序列长度为 1436 bp，含有 1 个 1098 bp 的完 整开放阅读框，编码 365 个氨基酸。与 NCBI 核酸和蛋白数据库中其他 7 种 COMT 基因的序列进行比对，结果序列相似性较高 (75%以上)。 (2)当归 4-香豆酸辅酶 A 连接酶基因(4CL)核心片段的克隆及序列分析:利用 RT-PCR 技术，得到了当归 4-香豆酸辅酶 A 连接酶基因(4CL)核心片段，该基因 片段 cDNA 序列长度为 514 bp，编码 170 个氨基酸。与 NCBI 核酸和蛋白数据 库中其他 7 种 4CL 基因的序列进行比对，结果显示序列相似性较高 (79%以上)。 (3) 当归 阿 魏 酸 -5- 羟 基 化 酶 基 因 (F5H) 全 长 的 克 隆 及 序 列 分 析 ( 登 录 号 : KP257433):利用 RT-PCR 和 RACE 技术，得到了当归阿魏酸-5-羟基化酶基因(F5H) 全长，该基因 cDNA 序列长度为 1839 bp，含有 1 个 1539 bp 的完整开放阅读 框，编码 512 个氨基酸。与 NCBI 核酸和蛋白数据库中其他 7 种 F5H 基因的序 列进行比对，结果显示序列相似性较高 (70%以上)。 (4)不同钾素水平对 COMT、4CL 和 F5H 基因表达的影响:荧光定量 PCR 结 果表明三个基因随着时间的延长相对表达量均逐渐增高。COMT 基因在前期根 系表达量高于茎叶，但后期茎叶相对表达量增高并超过根系；在茎叶和根系中 0 mmol/L K+处理对 COMT 的表达均有显著地抑制作用。4CL 基因在前期根系表达 量高于茎叶，但后期茎叶相对表达量增高并超过根系；且在茎叶中 0 mmol/L K+ 处理和 12.0 mmol/L K+处理均会抑制这种基因的表达。F5H 基因在茎叶的表达量 要显著高于根系表达量；在茎叶中，前期 0 mmol/L K+处理和 12.0 mmol/L K+处 理均对 F5H 的表达表现出一定的抑制性，后期 12.0 mmol/L K+处理的抑制性降 低，但 0 mmol/L K+处理仍表现出显著地抑制性，在根系中，12.0 mmol/L K+处理 对 F5H 的表达表现出显著地抑制性。 结论：(1)成功克隆出了当归 COMT 基因、F5H 基因的全长以及 4CL 基因的 核心片段，并在 Genbank 中注册，当归 COMT 全基因的登录号为 KP188587，当 归 F5H 全基因的登录号为 KP257433；(2)通过研究钾素水平对当归阿魏酸生物合 成相关基因表达的影响表明，6.0 mmol/L K+处理无论在当归幼苗茎叶中还是在根 系中均会对当归 COMT、4CL 和 F5H 基因的表达