碱性脂肪酶酵母菌的分离鉴定、诱变选育及其产酶条件的研究-微生物学专业论文.docxVIP

四JI{人学硕士学位论文碱性脂肪酶酵母菌的分离鉴定、诱变选育及其 四JI{人学硕士学位论文 碱性脂肪酶酵母菌的分离鉴定、诱变选育及其 产酶条件的研究 微生物学专业 研究生严建华 指导教师刘成君副教授 中文摘要 从成都龙泉果园采集的160份土壤样品中，经过第一轮和第二轮的反复 多级分离得到了42个在橄榄油初筛平板上有较好水解圈的菌株，初步的光 学显微镜的识别和平板菌落形态的观察比较，发现其中有霉菌也有酵母，由 于在培养基中加入了链霉素，所以基本上没有细菌的存在。以上分离到的菌 株经过初筛平板上多次划线分离直至纯种。 分离到的42个菌株再次在初筛平板上划线并用无菌牙签点种，对平板 上出现了较大水解圈的菌落测定其水解圈和菌落直径(mm)，发现十几株水 解圈直径和菌落直径之比(D／d)大于1。5的菌落。将这些(D／d)比值大于 1．5的菌落细胞活化后进一步用电位滴定法(用橄榄油乳化液作底物)测酶 活复筛，得到其中有12株在40℃、pH9．0条件下酶活达到40U／mL，经过几 次的反复传代并且在pI-19～9．5的条件下测发酵上清液的酶活，其中l铷酶活 最高达到了63．3U／mL，并且传代性质稳定，同时也证明该菌株所产脂肪酶是 一种碱性脂肪酶。经过一系列的细胞和菌落的形态学特征，培养特征以及该 菌株的生理、生化和遗传学特征的分类鉴定，初步鉴定该菌株为半知菌亚门， 期川人学硕士学位论文芽孢菌纲，隐球酵母目，隐球酵母科，假丝酵母属(Candida)胶淀粉假丝酵母 期川人学硕士学位论文 芽孢菌纲，隐球酵母目，隐球酵母科，假丝酵母属(Candida)胶淀粉假丝酵母 (Candida amylolenta)。 以酵母L30为出发菌株，进行了常规的紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG) 的诱变，在常规诱变的基础上又利用了其代谢的结构类似物琥珀酸纳处理和 能增加细胞透性的制霉菌素作用进行了高产菌株的选育。经过几轮上述过程 的处理和筛选，得到了7株在初筛平板上水解圈直径和菌落直径之比(D／d) 比出发菌明显提高的酵母，进一步测酶活进行了复筛，挑选出一株酶活达到 94U／mL的酵母菌bo-UNN，经过6次连续的传代测酶活其遗传性能稳定。 以l-eo．UNN作为发酵产酶条件研究的起始菌株。 对酵母bo—lYNN进行了发酵培养基成分和发酵培养条件的优化实验。结果 发现该酵母菌所产脂肪酶是一种诱导酶，碳源和pH值对其产酶量的影响较大， 最佳的种龄在18～24h之间。在培养基的起始pH9．0，接种量为4％时，其产脂 肪酶的最适培养基(％)为：豆饼粉4，蔗糖0．5，橄榄油2，(NH‘)。SO。0．1， Kz}{P吼O．2，JdgS04．7Hz0 0．03。在28。C，以170rpm的转速振荡培养72h时发酵 液的酶活达到最高为97U／mL，相对原始菌株酶活提高了54％。 关键词： 碱性脂肪酶，酵母，分类鉴定，诱变，产酶条件 四川大学碗上学位论文Screening、Identification 四川大学碗上学位论文 Screening、Identification and Breeding of a Candida yeast Producing Alkline Lipase and Studying on Its Fermentation Conditions Major：Microbiology Student：Yan JianHua Tutor：Hu ChengJun Abstract Twenty’two strains which hydrolyze oUve oil on the primal agar plates containing olive Oil were isolated from the 160 soil samples via to repeating isolate．Among these strains some are molds and the others are yeasts，through describing with optic microscope and analysis of the morphology of colony． Bacteria nearly cann、t be found for me reason of adding Streptomycin in the enrichment medium．All of these strains were purified by repeating lining Oll the agar plates． Preponderate over one decade strains were isolated from the 42 strains，their d