第十章-分子生物学技术4-6.pptVIP

GALUAS minimal promoter Reporter genes transcription AD Bait protein Library protein The two hybrid principle DNA-BD （一）酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是检测蛋白与蛋白相互作用的遗传分析实验，即检测蛋白质相互作用的实验。 三、蛋白质相互作用研究技术 1．酵母双杂交系统的基本原理 酵母双杂交系统的建立是基于对酵母转录激活因子GAL4分子的研究。如果将GAL4 分子的DNA结合区（binding domain，BD）和促进转录的活化结构域（activation domain，AD）分开，两者不能表现出对下游基因表达的激活作用。如果BD和AD分别融合了具有配对相互作用的两种蛋白质分子后，就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用。 2、模型 3、报告基因 LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity) LEU2 reporter - Screen on Leu+ media ADE2 reporter - Screen on Ade+ media URA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA) 4、假阳性的问题 假阳性是酵母双杂交系统的最大问题 假阳性通常由以下原因造成: prey蛋白的非特异性结合 无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（这是大多数假阳性的诱因） 5、酵母双杂交的优点 快速获得相互作用蛋白的基因 只需单一步骤的质粒构建 在体内鉴定蛋白的相互作用 弱小的，暂时的相互作用也能鉴定 能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号 6、酵母双杂交系统应用 （1）分析已知蛋白质之间的相互作用 （2）对蛋白质功能域的分析 （3）分析未知蛋白质相互作用 （4）绘制蛋白质相互作用系统图谱 （5）在药物设计中的应用 酵母双杂交应用举例 蛋白级联底物的鉴定 钙调蛋白与L-异天冬氨酰甲基转移酶的相互作用 E2F1 突变子的遗传特性 多肽荷尔蒙受体相互作用 Pha-4在线虫 C. elegans 中 的相互作用 （二）噬菌体展示（ phage display ）技术 是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合并呈现于噬菌体表面的技术。通过与特定的靶标反应（如抗体、受体、配基、核酸、以及某些碳水化合物等）可以使展示特定蛋白的噬菌体从表达有各种外源性蛋白的噬菌体肽库中筛选出来，再通过感染大肠杆菌使选择出来的噬菌体扩增，然后进行序列测定，可获得相应的结构和功能信息。 3种常用于表面展示的噬菌体为 M13, F1 , FD 利用病毒粒子表面蛋白构建多肽文库，每个噬菌体能展示一个任意的多肽 Solid phase selection with immunotubes Immunotube coated with antigen coated with steptavidin and biotinylated antigen B B B B B B B v v biotin antigen Solution phase selection with biotinylated antigen Bind to Streptavidin coated microtitre wells 通过噬菌体表面展示的蛋白可以与其靶蛋白相互作用，无论靶蛋白是抗原，蛋白或者病原，都可以快速有效地处理并用于筛选。 去除未结合的噬菌体病毒粒子，洗脱结合的噬菌体.可进一步扩增纯化的噬菌体，重复筛选或进行如下分析：a) ELISA；b) Specificity；c) Sequencing；d) Affinity；e) Activity。最终获得目标产物。 可用上述方式构建噬菌体抗体片段库，用于抗体筛选等研究。 是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。它是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 （三）免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）技术 是一种直接检测蛋白与蛋白相互作用的方法。 （四）免疫印记（ Western blot ）技术 Western blot 用于鉴定混合蛋白样品中的特异性蛋白及其相对分子质量。名字来源：DNA blot 最初是由E. M. Southern描