钾离子通道在小鼠精子获能中的作用及氰戊菊酯对获能的影响机制-卫生毒理学专业论文.docxVIP

钾离子通道在小鼠精子获能中的作用及氰戊菊酯 钾离子通道在小鼠精子获能中的作用及氰戊菊酯 对获能的影响机制 南京医科大学公共卫生学院 毒理学研究所神经毒理研究室 研究生 龚伟 导 师 肖杭 指导小组 王心如 高蓉 摘要 第一部分钾离子通道在小鼠精子体外获能中的作用 以金霉素(chlortetracycline，CTC)荧光染色法评价小鼠精子的体 外获能，并观察K+离子载体缬氨霉素(VaO对小鼠精子体外获能的影 响，CTC荧光染色后涂片观察，以B型精子的发生率来评价精子获能， B型精子发生率越高，获能越完全。 钾离子载体缬氨霉素能促使体细胞钾离子外流，实验以终浓度为 50nm01．L．1的缬氨霉素处理小鼠精子，其B型精子发生率(％)与 对照组相比显著增加(n=10，p0．05)，表明缬氨霉素能促进小鼠精子 的体外获能，由于缬氨霉素能促使体细胞内钾离子外流，提示在精子 体外获能过程中，钾离子外流是重要的一环。 进一步采用全细胞膜片箝技术记录小鼠粗线期精母细胞延迟整 流钾电流(IDRK)，并分析其电流特性，同时观察缬氨霉素对IDRK的 影响。结果显示：在小鼠粗线期精母细胞上能记录到一个被缓慢激活 南京医科大学颁卜学位论文的外向钾电流，其幅度随去极化电压的升高而增大，该电流的上升幅 南京医科大学颁卜学位论文 的外向钾电流，其幅度随去极化电压的升高而增大，该电流的上升幅 度具有明显的电压依赖性，但通道的开放没有明显的时间依赖性失 活。本实验使用的电极内液含有10mmol L。1的ca2-螯合剂EGTA，可 有效地防止胞内游离Ca2+浓度升高，因此该外向钾电流中基本不包含 Ca,2激活的钾通道电流，而且该电流对4-AP不敏感，但TEACI可显 著抑制该电流，因此可初步判断该电流为延迟整流钾电流(IDRK)。 进一步观察到加入50nm01．L。1缬氨霉素后，小鼠生精细胞上延 迟整流钾电流显著增大，1一v曲线上调。分析实验结果：缬氨霉素通 过激活延迟整流钾通道，增加胞内钾离子的外流，从而使精子膜电位 发生超极化，进而促发小鼠精子体外获能。 第二部分氰戊菊酯对小鼠精子获能的影响及机制探讨 200111小鼠精子细胞悬液加入不同终浓度氰戊菊／骑(Fen)染毒后， C02孵箱37。C培育2小时， 结果显示：以终浓度(“mol Lq)为0、 0．625、1．25、 2．5、 5．0、 10．0、 20．0的Fen处理小鼠精子，其B 型精子发生率(％)分别为55．05±0．43、52．02±1．29、47．13±0．87、 40．08±0．32、35．79±0．88、28．66±0．96、27．89±1．56，半数有效剂量 (ED50)为5¨t001．L～。表明氰戊菊酯抑制小鼠精子体外获能，其作 用呈剂量一反应关系(p0．05，n=12)，同时具有时间依赖性。 我们进一步探讨了Fen抑制小鼠精子体外获能机制，发现氰戊菊 酯可轻微抑制小鼠粗线期精母细胞延迟整流钾电流，提示氰戊菊酯主 要不是通过延迟整流钾离子通道途径影响精子体外获能。同时实验还 观察到，氰戊菊酯能显著抑制精予细胞膜的脂质流动性。我们选择l， 6-二苯已三烯(DPH)为荧光探针结合细胞染毒，测定小鼠精子细胞 膜脂质的荧光偏振度(P值)，来观察氰戊菊酯对精子细胞膜脂质流 动性的影响。结果表明，以0、0．625、1．25、2．5、5．0、 10．0、20．0 u u tool L。的Fen处理小鼠精子，从2．5 u t001．L_起，氰戊菊酯即显著 增高小鼠精子细胞膜脂质DPH探针的荧光偏振度(P值)、降低膜脂 质流动度LFU(P0．05，n=15)；10“mol L一一20“mol L。1浓度的 氰戊菊酯组，其P值与LFU到达平台期。提示氰戊菊酯可增高小鼠 精子细胞膜脂质的荧光偏振度，降低细胞膜脂质流动性，并具有浓度 依赖关系。经相关分析发现，氰戊菊酯抑制小鼠精子体外获能及降低 精子细胞膜脂质流动性，这两者的作用剂量高度相关(r2=0．968)，提 示氰戊菊酯可通过降低精子细胞膜的脂质流动性而抑制小鼠精子体 外获能。 关键词：精子体外获能延迟整流钾电流氰戊菊酯 膜脂质流动性 塑塞垦型查堂塑!：羔!i堡塞 塑塞垦型查堂塑!：羔!i堡塞 Correlation between the mouse sperm capacitation state and K+channel and mechanism of fenvalerate inhibiting capacitation Laboratory ofneurotoxicology,Institute ofToxicology， School ofpublic Health，Nanjing Medical university Pos