甲型H1亚型流感病毒检测方法的建立及应用-预防兽医学专业论文.docxVIP

{1ⅢY洲2lm0洲0州Ⅲ4㈣0 {1ⅢY洲2lm0洲0州Ⅲ4㈣0I 0州51lll 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 孕 如需保密，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果．尽我所知，除了文中特别加以标洼和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 两使用过的材粹，指导教师对此进行了审定．与我一固工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意． 研究生鞔是1 帆刎年l；月；弓日 学位论文使用授权书 本入完全了解华中农业大学关予保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电予版本；学校有权保存提交论文的印劂版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务．可以采用影印、缩印或扫描等复钊手段保存．汇编学位 论文．本入同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的金 郊或部分内容，同对本人保留在其他媒体发表论文的权力． 注：保密学位论文(印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文)在解密后适用予本授权书． 学位论文作者鼢走目t、 导蝴：刍裼-毋 签名日期：Wfl年占月l多日 签名日期： 如ff年多月7多日 注：请将本袭囊接装订在学位论文的球页和Ej袋之闻 本研究由 本研究由 国家重点基础研究发展计划(973计划) “流感病毒重组机制’’(2010cB534002)项目资助 ●t1 ■■ⅡV●●，3 1．1．3流感诊断方法 5 1．2单克隆抗体研究 6 1．3研究目的与意义 一7 2．抗甲型H1亚型流感病毒血凝素单抗克隆抗体的制备及鉴定 9 2．1材料 ．．9 2．1．1生物材料 9 2．1．2主要试剂 9 2．1．3主要材料及仪器设备 9 2．1．4主要试剂配制 ·10 2．2方法 10 2．2．1抗原制备 “10 2．2．2小鼠免疫 11 2．2．3细胞融合 11 2．2．4阳性杂交瘤细胞筛选 ”13 2．2．5阳性杂交瘤细胞克隆化 ·13 2．2．6单克隆抗体的鉴定 13 2．3结果 1 5 2．3．1融合后筛选及克隆化培养结果 ·15 2．3．2染色体计数结果 ·16 2．3．3单抗亚类鉴定结果 ”16 2．3．4单抗HI效价 17 2．3．5单抗特异性试验结果 ·l 8 2．3．6 TCID50的测定 19 2．3．7间接免疫荧光结果 ·19 2．3．8稳定性检测 ”20 华中农业大学201 华中农业大学201l届硕士研究生学位论文 2．4讨论 21 2．4．1抗原的制备及免疫 ”21 2．4．2细胞融合和筛选 21 2．4．3杂交瘤细胞的克隆及冻存复苏 22 2．4．4杂交瘤细胞株建立过程污染控制 ”22 2．4．5单克隆抗体特异性的鉴定 ～22 2．4．6染色体计数 22 2．4．7间接免疫荧光 ”23 3甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA方法的建立及应用 24 3．1材料 24 3．1．1生物材料 24 3．1．2主要试剂 24 3．1．3主要试剂的配制 24 3．2方：法 ·25 3．2．1单克隆抗体腹水的纯化 25 3．2．2抗体浓度及效价的测定 25 3．2．3辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体 26 3．2．4甲型HI亚型流感病毒双抗体夹心ELISA方法的建立 一26 3．3结果 30 3．3．1单克隆抗体的提纯及检测 ·30 3．3．2双抗体夹心ELISA检测方法包被抗体和酶标抗体配对的确定 ·31 3．3．3方阵滴定的方法确定包被抗体及酶标抗体浓度 ．．31 3．3．4临界值的确定 ”32 3．3．5封闭液的选择 32 3．3．6特异性试验 ”33 3．3．7敏感性实验 33 ．8临床试验 34 ．9甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒的组装 ”35 ”36 ．1辣根过氧化物酶标记单克隆抗体 ”36 ．2包被抗体和酶标抗体最佳配对的选择 ”36 ．3封闭物的选择 36 ．4临界值的确定 ·36 ．5试剂盒特异性、敏感性试验 ”37 ．6本试剂盒创新处 37 抗甲型HI亚型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制各及初步应用4甲型H1亚型流感病毒免疫胶体金检测方法的建立 抗甲型HI亚型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制各及初步应用 4甲型H1亚型流感病毒免疫胶体金检测方法的建立 38 4．1材料 38 4．1．1生物材料 ·38 4．1．2主要试剂及材料 ·38 4．1．3主要试剂的配制 ”38 4．2方法 39 4．2．1试验器皿的清洁 “39 4．2．2胶体金的制备 ·39 4．2．3金标抗体的制备 ·39 4．2．4结合垫、样品垫的预处理 ·39