羧酸酯酶BioH的克隆表达及其水解活性的定向进化.PDF

浙江大学学报 农业与生命科学版 396 607~612 2013 JournalofZheian Universit A ric LifeSci j g y g htt www ournals zu edu cn ar p j j g E-mail zdxbnsb@zu edu cn DOI 10 3785 issn 1008-9209 2013 01 091 j j 羧酸酯酶BioH的克隆表达及其水解活性的定向进化 徐红娜 于洪巍* 浙江大学化学工程与生物工程学系生物工程研究所 杭州 310027 摘要 通过分子克隆手段获得大肠杆菌来源的羧酸酯酶 采用定向进化的方法提高该酶的水解活性以提升 BioH 其应用价值 通过 扩增 从大肠杆菌 菌株中克隆得到羧酸酯酶 基因 目的基因长度为 含 PCR K12 BioH 771b p 个氨基酸 将其连接到 质粒上并转入 宿主细胞中 经诱导表达得到所需的目的蛋白 256 ET30a+ BL21DE3 p 该蛋白分子质量约为 野生型的 水解对硝基苯丁酸酯 的活性为 且该酶具有良 28 2ku BioH -NPB 18U m p g 好的热稳定性 以 为底物进行高通量筛选 其水解底物为对硝基苯酚 在 处有最大吸收 -NPB -NP 405nm p p 峰 挑选出水解活性提高的突变体 并通过 轮定向进化过程 成功筛选到 个水解活性提高的优良突变体 它们 2 7 的活性分别提高了 结构分析表明 突变体的突变位点均分布在远离活性中心的位置 20%~100%