秸秆降解菌黄绿木霉木聚糖酶基因的克隆及高效表达-生物学;微生物学专业论文.docxVIP

Classified Classified Index： Code： 10224 Confidential(yes／no)-no NO．：120210030 Dissertation for the Professional Master Degree Cloning and Expression of Straw Degradation Strains Trichoderma Aureoviride Xylanase Gene Candidate：Sun Xudong Supervisor：Professor Huang Xiaomei Degree Category：Master of Science College：College of Life Science First level discipline：Biology Second level discipline：Microbiology Harbin China June 2015 万方数据 墒亘 墒亘 1掣IIIl2I 17117IIl2II 1II必III 目录 摘要 ．：一：工一-．=．I_．：= ．I 万方数据 东北农业大学理学硕士学位论文3．3表达载体的构建及毕赤酵母转化 东北农业大学理学硕士学位论文 3．3表达载体的构建及毕赤酵母转化 28 3．3．1表达载体的构建 28 3．3．2重组表达载体的毕赤酵母转化 ．．29 3．3．3毕赤酵母重组子的鉴定及其诱导表现型鉴定 30 3．4重组毕赤酵母的诱导表达及实时荧光定量PCR分析 31 3．5重组木聚糖酶的酶学特性分析与动力学常数测定 一32 3．5．1木糖标准曲线的绘制 ．32 3．5．2重组木聚糖酶的SDS．PAGE分析及其活性电泳 32 3．5．3重组木聚糖酶蛋白的酶学特性分析 34 3．5．4不同底物对木聚糖酶酶活性的影响及其酶促动力学分析 37 3．6黄绿木霉及重组毕赤酵母产木聚糖酶的发酵条件优化 ．．41 3．6．1培养时间对黄绿木霉及重组毕赤酵母木聚糖酶活性的影响 41 3．6．2 pH对黄绿木霉及重组毕赤酵母木聚糖酶活性的影响 42 3．6．3黄绿木霉及重组毕赤酵母最优发酵条件的正交试验设计 43 4讨论 ．．46 4．1木聚糖酶基因的克隆 46 4．1．1基因供体的选择 ．46 4．1．2基因表达系统的选择 ．46 4．1．3表达载体的选择 ．47 4．1．4基因片段的克隆 ．47 4．2基因生物信息学分析 47 4．2．1木聚糖酶基因序列分析 ．．47 4．2．2木聚糖酶蛋白结构分析 ．．48 4．3重组毕赤酵母诱导表达量的实时荧光定量PCR分析 48 4．4毕赤酵母转化子的PCR鉴定 ．．49 4．5木聚糖酶酶学特性分析 49 4．6黄绿木霉与重组毕赤酵母木聚糖酶酶活性对比 ．49 5结论 ．．51 致谢 52 参考文献 ．．53 附录 60 攻读硕士学位期间发表的学术论文 65 II 万方数据 CONTENTSCoNTENTS CONTENTS CoNTENTS Abstract in Chinese．．．．．．．．．． ． ．．．．． ．． ．．． ．． ．．．．．． ． ．．．．．． ··I Abstract in English ．． ．．． ．．． ．．．．．．． ．． ．．-．． · ·-·III 1 Introduction 1 1．1 Purpose and significance of research ．．． ．．．．．． ．． ．．．．． - ． ．．．．． ·-·· ····· ··- ·1 1．2 Xylan．．．．．．．．．．．．． ． ． ．．．．．．．．．．．． ．．． ．．．．． ．．． ．．．．． ．． ．．．．． ．． ．．．．． -．． “2 1．2．1 The structure of xylan．．． ．．． ．．．．．． ．．．．． ．．．．． ．． ．。．． -．-．．． ．2 1．2．2 The degradation ofxylan enzyme system ． -·-· --· ··-· - 2 1．3 Xylanase ．． ． ．．．． ． ． ．．．．．． ． ．．．．．．． ．．．． ．．．．．． ．．．．． ·3 1．3．1 Classification and action mechanism ofxylanase ． 一3 1．3．2 Xylanase enzyme properties．．． ．．．．．．．．．．．． ． ．．