胶质瘤干细胞的3D培养及其核酸适体筛选的探索-外科学专业论文.docxVIP

福建医科大学硕士论文 福建医科大学硕士论文 福建医科大学硕士论文 福建医科大学硕士论文 - - PAGE 10 - - - PAGE 11 - 目 录 英文缩略表 - 4 - 摘 要 - 5 - Abstract - 6 - 前 言 - 8 - 第一部分 胶质瘤干细胞的 3D 培养 ??????????-9- 1.1 引 言 …………………………………………………………-9- 1.2 实验材料： ……- 10 - 1.3 实验方法： - 11 - 1.3.1 细胞培养 - 11 - 1.3.3 μCGA 的制作 - 12 - 1.3.4 单细胞增殖能力异质性分析 - 13 - 1.3.5 胶质瘤干细胞的 CD133 及 Nestin 鉴定 - 13 - 1.4 结果 - 14 - 1.4.1 μCGA 单细胞捕获- 14 - 1.4.2 μCGA 单细胞长期培养可行性实验 - 15 - 1.4.3 三维培养条件下的单细胞增殖能力异质性分析 - 15 - 1.4.4 胶质瘤干细胞的鉴定 - 19 - 1.5 讨论 - 20 - 1.6 小结 - 22 - 第二部分、胶质瘤干细胞核酸适体筛选及应用 - 23 - 2.1 引言 - 23 - 2.2 实验材料 - 25 - 2.2.1 试剂与仪器 - 25 - 2.2.2 DNA 文库合成 - 27 - 2.3 实验方法 - 28 - 2.3.1 细胞培养 - 28 - 2.3.2 胶质瘤干细胞的核酸适体筛选 - 28 - 2.3.3 检测库的富集情况- 30 - 2.4 结果 - 31 - 2.4.1 细胞培养 - 31 - 2.4.2 琼脂糖电泳凝胶图- 32 - 2.4.3 流式细胞仪监测核酸适体的筛选进程 - 32 - 2.4.4 富集库的亲和力测定 - 33 - 2.5 讨论 - 35 - 2.6 小结 - 38 - 全文结论 - 38 - 参考文献 -399- 综 述 -544- 致 谢 ………………………………………………………………………………………….-58- 福建医科大学硕士论文 福建医科大学硕士论文 福建医科大学硕士论文 福建医科大学硕士论文 英文缩略表 SELEX Systematic Evolution of Ligands 配体的指数富集系统进化 GBM Glioblastoma multiforme Collection 多形性胶质母细胞瘤 TN-C tenascin-C 肌腱蛋白-C ATCC American Type Culture Collection 美国模式培养物保藏库 PCR BSA Kd μ-TAS μCGA GSC Polymerase Chain Reaction Albumin from Bovine Serum dissociation constant miniaturized total analysis system Microcollagen gel array glioma stem cells 聚合酶链反应 牛血清白蛋白 解离常数 微全分析系统 微胶原蛋白阵列芯片 胶质瘤干细胞 摘 要 目的:1、拟采用 3D 培养技术模拟体内环境研究胶质瘤干细胞增殖的异质性及一些 生物特性。 2、在体外进行人工合成核酸适体文库合成，使用 Cell-SELEX 技术进行筛选， 以期得到可以特异性识别胶质瘤干细胞的核酸适体。 方法：1、利用微孔阵列芯片技术制作出高通量微胶原蛋白阵列，然后使用 固定力的按压方式，使细胞均匀分布于阵列中，形成三维培养模型。三维长期培 养条件下，进行高通量胶质瘤干细胞单细胞异质性分析。 2、使用化学方法人工合成的随机寡核苷酸库，以体外培养的的人胶质母细 胞瘤细胞系 U251 细胞诱导出的胶质瘤干细胞为靶细胞，以人胶质母细胞瘤细胞 系 U251 细胞为反筛细胞，利用 Cell-SELEX 技术，进行核酸适体筛选。 结果：1、胶质瘤细胞可以高通量微胶原蛋白阵列中长期存活，并且增殖，细胞活 性没有影响。 2、经过 7 天、30 天培养，观察、鉴定，3D 培养条件下可以观察到胶质瘤 干细胞与胶质瘤细胞之间的增殖能力差异及各自细胞传代过程中异质性。 3、经过 15 轮循环的筛选得到了可以结合胶质瘤干细胞的核酸适体文库 4、这个核酸适体库可以很好地与人脑胶质瘤干细胞结合，而不与人脑胶质 瘤细胞系 U251 相结合。 结论：1、建立了一种高通量单细胞三维培养平台，用于胶质瘤干细胞细胞异质性 的分析。胶质瘤子细胞传代具有局限性，而胶质瘤干细胞几乎可以无限增殖。 2、筛选得到的核酸适配体库可以特异性的结合于靶细胞表面的靶标蛋白分 子，为适配体在寻找胶质瘤干细胞的生物标志物，以及胶