胶质瘤特异性肽疫苗相关肽及胶质瘤特异性启动子的鉴定-细胞生物学专业论文.docxVIP

中文摘要目 中文摘要 目 的 多形胶质母细胞瘤(GBM)大约占所有已诊断脑肿瘤的三分之一。尽 管应用各种治疗方法，包括手术切除，放疗和化疗，多形胶质母细胞瘤患者 的预后仍极差，因此开发新的特异性的胶质瘤治疗方法成为当务之急。有 临床应用前景的治疗方法包括基因疗法和免疫疗法。 对于肿瘤相关抗原的克隆和分析，以及对于可被细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)识别的肽片段的鉴定，为肿瘤的免疫治疗提供了新的可能性。近年 来，研究者在开发肿瘤的免疫治疗方法方面进行了大量的努力，不论在体内 还是在体外，均取得了令人鼓舞的结果。对于胶质瘤相关抗原如tenacin， gp240和EGFRvlII的克隆和鉴定，使有效的胶质瘤免疫治疗成为可能。 EGFRxrIII突变存在于60—70％的多形胶质母细胞瘤和胶质肉瘤中。这种 突变型受体不存在于任何正常组织中，这使它成为胶质瘤免疫治疗的适宜 靶点。随着从骨髓或外周血单核细胞(PBMC)中分离和培养树突状细胞 (DC)：疗法的发展，应用装载有肿瘤相关抗原的同源树突状细胞进行免疫已 经成为一种非常有前途的肿瘤免疫治疗方法。在抗肿瘤实验中，DC可以 装载肽(肽疫苗)，肿瘤碎片或重组蛋白质，其中，研究最广泛的是肽疫苗。 研究显示，应用装载有肽片段的DC进行免疫，可以产生针对多种人类肿瘤 的肿瘤抗原特异性CTL。然而，开发肽疫苗的一个最主要的挑战就是鉴别 可以用做肿瘤抗原特异性CTL靶点的肽片段。现在已确定的大多数肿瘤 相关抗原的CTL结合肽均与HLA a s 0201基因型相关，这种基因型是世界 上大多数种族中主要的HLA亚型。因此，鉴定受HLA a+0201限制的恶性 胶质瘤抗原相关的CTL结合肽，将在恶性胶质瘤的免疫治疗方面起十分重 要的作用。另外，HLA a。0201转基因鼠已经建立，并被用来确定来源于肿 瘤相关抗原的人CTL肽的免疫原性。综上所述，基因型为HLA a*0201的 恶性胶质瘤细胞系对于鉴定CTL相关肽，以及在体内和体外评价恶性胶质 瘤免疫治疗方法具有十分重要的意义。 因此，在本研究中，我们的第一个目的是：通过PCR—SSP和自动测序 法鉴定几种基因型为HLA 法鉴定几种基因型为HLA a臻0201的恶住胶威瘤细胞系，并迸一步证实这 些新鉴定的珏酞a冰0201胶凌瘸缀稳系是否莓以用予开发恶性狡璇癯豹 免疫治疗方法。 近年来，研究者已经鉴定了许多可被肿瘤特异性CTL识别的肽片段， 但其中大多数都与黑色索瘤特异性抗原如：tyrosinase，tyrosinase相关蛋白 1和2，gpl00，MAGE一1和MAGE～3等褶关。而起源子EG豫viii，受 MHC l型分子(如羽盖a宰0201)限制的款片段尚没有被签定。 嚣戴，本研究豹第二令鬟戆是：鉴定受珏姒8母0201限定的胶质癀特 异性抗愿EGFRvllI相关肽，势证实他们予体外诱导产生肿瘤特异性CTL的 能力。 在过去的十年中，研究者分离得到许多肿瘤组织特异性启动子和增强 子序列，并将他们用予恶性肿瘤的基因治疗。一种可能鸯胶质癌特异豫窟 囊子调控懿基嚣(1己一13Ra2)最近扶人学癌细胞系孛被竟隆出来。许多涯 据显承lL—13Ro【2在大多数人恶性胶质瘸中赢表达。另外，IL一13Ra2基 因在正常脑组织及人体其他正常器官中的表达微乎其微。人IL～13Ra2 基因的这种特性使它成为蛋白质／肽为基础的疫菌或免疫毒素治疗的理想 靶点。 尽管lL一13Ra2是一种重要的受疫骥节分子翱肿瘤治疗的靶分子，他 在大多数胶覆瘸发生发展中所起的佟用仍不清楚，两且尚无人理解此基因 表达的调节机制，对于调节此基因表达的顺式调节元件和反式作用因子的 鉴定，将可以协助我们解释IL一13Rot2在人备种组织中的特殊表达方式， 同时也可以使我们阐瞩此分子在免痰调节和嚣申瘤发生中的作用。 嚣踅本研究懿第三令鬟的楚：竞隆入IL一13Ra2基因启动子，并确定 对此定动子功能起决定作用的调节区域。 恶性胶质瘤患者的不良预詹使IL一13Ra2基因相关疗法的研究显得 尤为重要。Mouse和rat是恶性胶质瘤临床前期实验最常用的两种动物模 墅。因此，我们应该了解与入IL一13Ra2基因褶似的l／lOUSe和rat体内的相 关基溺。Donaldson等酝经克隆了mouse的毯一13陇基嚣。 隧越本研究的第四个是的是：克隆rat的IL一13Rce2基因并检测此基 因在rat各种组织中的表达情况。 ·2· 方 方 法 1．用PCR—SSP和自动测序法进行基因型鉴定 PCR—SSP可以分辨HLA A2和菲HLA A2等位基因。HLA A2阳往标 本的ENA扩增片段应耀PCR缝化试剂盒纯化并送交AGAC(Saint Paul， MN)测序。根据HLA A2钋显予2；}援外显子3的共阉序歹l』设计测