结合珠蛋白在正常及病损皮肤中的表达-皮肤病与性病学专业论文.docxVIP

中文摘要目 中文摘要 目 的 1．探讨在正常及炎症刺激后，结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)mRNA在 小鼠表皮、真皮、表真皮组织中的表达情况，并采用原位杂交方法进行定位 观察，以确定Hp mRNA在皮肤中的表达位置及其与炎症的关系。 2．在mRNA水平探讨正常人皮肤中Hp的表达，以进一步观察Hp mRNA在皮肤中表达的确切位置及其在不同部位皮肤中的表达差异；在蛋 白质水平上研究Hp在正常人皮肤中的表达情况。 3．探讨Hp mRNA在银屑病患者皮损及皮损周边外观正常皮肤、扁平 苔藓、红皮病、脂溢性角化病、寻常疣、基底细胞上皮瘤、鳞癌、系统性红斑狼 疮患者皮损及曝光部位正常皮肤、天疱疮、大疱性类天疱疮患者皮损中的表 达，进一步确定Hp mRNA在皮肤中的表达位置及在不同皮肤病中表达的 差异；并在蛋白质水平观察Hp在上述皮损中的表达情况。 材料和方法 1．标本收集 1．1实验动物 C57BL／6小鼠20只，分为生理盐水组和细菌脂多糖(LPS)刺激组，每 组10只。均为雌性，2～4月龄。分别获取表皮、真皮和表真皮组织。 1．2正常人皮肤 30例正常成人皮肤来自外科手术患者，男19例，女11例。其中头皮2 例，面部6例，躯干部13例，四肢9例。取材部位无肿瘤及炎症性皮肤病损 害，所取皮肤组织均去除皮下脂肪组织。 1．3皮肤病患者皮损 寻常型银屑病22例，其中进展期14例，稳定期8例，同时取16例患者 的皮损周边外观正常皮肤；扁平苔藓16例；红皮病8例(2例由蕈样肉芽肿 诱发，3例由银屑病诱发，3例由湿疹诱发)；脂溢性角化病15例；寻常疣10 例；基底细胞上皮瘤IO例；鳞癌10例；系统性红斑狼疮12例，同时取lo例 患者的曝光部位正常皮肤；天疱疮10例，其中寻常型7例，红斑型3例；大 ·1· 疱性类天疱疮10例。以上患者均经临床、组织病理及免疫病理学等检查确定诊断。 疱性类天疱疮10例。以上患者均经临床、组织病理及免疫病理学等检查确 定诊断。 2．实验方法 2．1半定量RT—PCR 2．1．1小鼠组织总RNA的提取 所取组织制成匀浆后，用异硫氰酸胍一酚一氯仿一步法提取总RNA。 2．1．2总RNA浓度、纯度和完整性测定 用紫外分光光度仪测定RNA在260nm和280nm处的光密度值，以确 定RNA的浓度和纯度。用1．5％甲醛琼脂糖凝胶电泳证实RNA的完整 性。 2．1．3对小鼠组织所提取的RNA进行RT—PCR检测 分别按照要求制备反应体系并在特定条件下完成反转录及PCR反应， 每一个标本均分别用Hp和内对照B—actin引物对进行PCR扩增。lip特 异性扩增片段长度为475bp，B—actin特异性扩增片段长度为540 bp。 2．2原位杂交法检测 2．2．1所有小鼠表真皮、正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均按 照要求在一25℃恒冷切片机上制备12p,m厚的切片。 2．2．2采用小鼠及人Hp原位杂交检测试剂盒进行检测。针对小鼠及 人Hp的cDNA探针序列如下：5’一AGTGC TCCAC ATAGC CATGT GCKAT CTCGG一3’，5’一CCTGC CAGGG AAAGC 1优CT TrGGC ATCCA一3’，5’ 一CATAC CAGGT GTCCT CCTCC AGGTC GTGAA一3’。 2．2。3对照的设立：阳性对照为小鼠肝组织；阴性对照为同一标本的切 片省略生物素化鼠抗地高辛或省略探针。 2．3免疫组织化学[链霉卵白素标记的亲合素、生物素(LAB—SA) 法)]染色 对所有正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均用抗一Hp单克隆抗 体、生物素标记的羊抗小鼠IgG及辣根酶标记的链霉卵白素进行检测。 2．4免疫荧光双标记检测 对所有正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均用抗一Hp单克隆抗 体、罗丹明标记的羊抗鼠IgG和FITC标记的CDla单克隆抗体进行检测。 3．结果判断标准 ·2· 3．1 3．1 PCR产物的检测 扩增产物在1．5％琼脂糖凝胶中电泳，紫外凝胶成像系统上照相。电 泳结果采用FlourChem V 2．0凝胶成像分析软件(America)分析，记录每条 DNA扩增带的灰度值，将每一个目的DNA扩增片段的灰度值与相应的内 对照p—actin扩增片段的灰度值的比值(e／c)作为每一个目的基因mRNA 的半定量指标。 3．2原位杂交结果 细胞浆染成桔红色为阳性，结果用Meta Morph Imaging System软件处 理，按图象灰度结果分为五个等级：无染色，灰度值不少于130，为阴性 (一)；轻微染色，灰度值在125～130之间，为弱阳性(±)；染色较浅，灰度 值在115～125之间，为阳性(+)；染色较深，灰度值在105～115之间，为较 强阳性(++)；染色深，灰度值不大于105，