课件：一抗、二抗的选择.ppt

IgA 分血清型和分泌型两种， 血清型多为单体，也有二聚体，血清型IgA可介导调理吞噬ADCC 作用； 分泌型的都是二聚体，且含有分泌片。 分泌型IgA（SIgA）是机体粘膜防御系统的主要成分，覆盖在鼻、咽、气管、肠和膀胱粘膜的表面，它能抑制微生物在呼吸道上皮附着，减缓病毒繁殖，是粘膜重要屏障，对某些病毒、细菌和—般抗原具有抗体活性，是防止病原体入侵机体的第一道防线。 外来抗原进入呼吸道或消化道，局部免疫系统受到刺激后，无需中央免疫系统的参与，自身就可进行免疫应答，产生分泌型抗体，即SIgA。 已有研究证明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影响呼吸道粘膜对病原体的抵抗力，两者呈正相关。 初乳中含有分泌型的sIgA　。 IgA的凝聚物可以通过经典途径激活补体。 IgA 人体血清免疫球蛋白IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在。 大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，它在抗感染中起到主力军作用，它能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用（调理作用），中和细菌毒素的毒性（中和毒素）和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力（中和病毒）。 IgG 在机体合成的年龄要晚于IgM，在出生后第3 个月开始合成，3-5 岁接近成年人水平。 它是唯一能通过胎盘的Ig，在自然被动免疫中起重要作用。此外，IgG 还具有调理吞噬和结合SPA等作用。 IgG 【Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】 在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择Anti-IgG, F（ab’）2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部分与IgG的非特异性结合。 常规的Anti-IgG （H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即与IgG的Fc的F（ab’）2片段都能结合； 由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG （H+L）与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment经过了IgG Fc片段的吸附，因此只与IgG的F（ab’）2片段结合。 针对某一种属的抗体可能会和其他一些种属有交叉反应。牛血清白蛋白和奶粉可能含有与抗牛IgG、抗山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG等抗体反应的IgG，因此如果使用它们作为封闭液或抗体稀释液的成分，会增加背景染色和降低抗体的效价。 简单说，如果用的是抗牛IgG、抗山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG的二抗，那么封闭过程中就尽量不要用牛血清白蛋白和奶粉，以免交叉反应造成背景染色增加和抗体效价降低。 一抗、二抗的选择 一抗的选择 1.分析实验应用类型 WB（Western Blot 免疫印迹 ） IHC （immunohistochemistry免疫组织化学） ELISA（enzyme-linked immunoadsordent assay 酶联免疫吸附试验 ） 2.样本蛋白的结构性质 样本蛋白的结构域 全长蛋白、蛋白片段、多肽、 细菌、细胞 样本的提取和处理过程 某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本， 某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织， 另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织， 蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域 用含此片段域的免疫原制备出的抗体。 用FACS流式检测活细胞的表面蛋白 用含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。 3.样本的物种 选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy?和?NCBI?BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。 4.一抗宿主物种的选择 一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应， 例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。 如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本的western?blot