金丝桃素抗弓形虫效果的研究-病原生物学专业论文.docxVIP

附录 B 常用试剂配制……………………………………………… 45 附录 C 个人简历及发表论文……………………………………… 47 附录 D 综述………………………………………………………… 48 PAGE PAGE 1 金丝桃素抗弓形虫效果的研究 中文摘要 目的： 1．实验研究金丝桃素对体外培养的弓形虫速殖子的杀伤作用，以及金丝桃 素对弓形虫形态结构、超微结构影响。2．探讨金丝桃素对体外培养的弓形虫细 胞逸出现象的影响。3．探讨金丝桃素对急性弓形虫感染小鼠的治疗作用及其可 能的细胞免疫调节机制。 方法： 1．调整虫体密度为 1×106 个/ml/孔于 24 孔板中，设 4 个实验组：生理盐水 组、金丝桃素 5μg/ml、50μg/ml、 500μg/ml 浓度组，定容至 1ml/孔。37℃孵育， 2h、4h、6h 分别取各组样本液，进行台盼蓝和姬姆萨染色，光镜下观察虫体着 色情况和虫体结构。电镜观察药物浓度为 500μg/ml 作用 2h、4h、6h 后，虫体的 超微结构的变化。 2．用 RH-YFP 弓形虫模拟方法 1 实验方案利用荧光显微镜观察和流式细胞 仪检测金丝桃素对弓形虫的杀伤作用；分离小鼠腹腔巨噬细胞，建立弓形虫与巨 噬细胞共培养体系，实验分 4 组:巨噬细胞+弓形虫组、巨噬细胞+弓形虫+金丝桃 素组（金丝桃素浓度：100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml），分别在培养 1h、2h、 3h 后用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测，检测感染细胞、游离速殖子在不同 药物浓度及不同时间比例的变化。 3．利用弓形虫 RH 株（1×103 个/只）建立小鼠弓形虫体内感染模型，实验 分成空白组、感染组、金丝桃素组、金丝桃素治疗组 4 个实验组。感染 12 小时 后金丝桃素对照组和治疗组开始给药，连续治疗 7 天。观察小鼠存活时间，利用 流式细胞仪检测 7 天后小鼠脾脏中 T 淋巴细胞亚群的变化。 结果： 1．金丝桃素和弓形虫速殖子共培养后，随着时间的变化，同一浓度组台盼 蓝着色率不断升高，在相同的时间段内，随着药物浓度的增加，虫体台盼蓝着色 率也在升高。吉姆萨染色实验，其中 500μg/ml 浓度组 2h 虫体内部出现空泡，4h 后虫体膨胀，核质分不清，6h 后虫体染色进一步加深。透射电镜下速殖子超微 结构的变化，生理盐水组虫体轮廓清晰，电子密度高，内容物清楚，6h 内基本 维持正常形态。金丝桃素处理组 2h 后，虫体开始肿胀，钝圆，胞质内开始出现 空泡，核固缩。4h 后虫体变圆，空泡变大，胞膜出现孔洞，有内容物溢出。6h 后虫体轮廓消失，不见细胞膜，内部结构基本呈溶解样改变，电子密度很低。 2．弓形虫对照组 6h 内虫体数目形态基本没有变化，500μg/ml 作用 2h 虫体 开始钝圆，荧光轮廓变小，4h 后荧光速殖子明显减少，6h 后基本不见荧光；巨 噬细胞组金丝桃素干预 3h 细胞形态未发生明显改变。与巨噬细胞+弓形虫组相 比，巨噬细胞+弓形虫+金丝桃素组随着药物浓度增加和时间的延长胞内速殖子 数量下降明显，游离速殖子也在减少且荧光强度不断降低。流式细胞仪检测结果， 弓形虫对照组 6h 内阳性区域比例变化不明显，药物处理 2h，500μg/ml 药物浓度， 游离速殖子阳性区域比例开始小于 0.1%；巨噬细胞+弓形虫+药物组随着时间的 延长和药物浓度增加，游离/胞内弓形虫的比值开始不断升高直到 400μg/ml 作用 3h 才开始下降，各时间段实验组与对照组比较均显著升高。 3．对 40 只小鼠进行连续 7 天干预治疗后，金丝桃素组，金丝桃素治疗组， 空白组 30 只小鼠全部存活，感染组小鼠只存活了 5 只。7 天后处死小鼠进行腹 水检查发现，金丝桃素治疗组小鼠腹腔速殖子含量较感染组少。小鼠脾淋巴细胞 检查结果发现金丝桃素对照组和治疗组 CD4+ T 淋巴细胞比例较其他 2 组显著升 高，而感染组小鼠脾 CD8+ T 淋巴细胞比例较其他 3 组也显著升高。CD4+/CD8+ T 淋巴细胞比例金丝桃素对照组和治疗组显著高于空白对照组与感染组。 结论： 1．在体外培养环境下，金丝桃素对弓形虫速殖子有显著的杀伤作用， 500μg/ml 浓度 4h 就可以达到 95%以上的杀伤效果，与同一浓度 4h 在荧光显微 镜下虫体荧光消失和电镜下虫体超微结构变化相一致。 2．体外药物实验证实了金丝桃素能够诱导弓形虫速殖子从宿主细胞逸出， 降低宿主细胞的感染率，同时对逸出的游离速殖子具有杀灭作用。 3．通过金丝桃素治疗小鼠弓形虫病的体内实验表明，金丝桃素可以影响弓 形虫感染小鼠体内 CD4+/CD8+ T 淋巴细胞亚群比例的变化，延长了感染弓形虫小 鼠的存活时间。 关键词：弓形虫；金丝桃素；流式细胞仪；YFP Study o