局部高密度扩增骨髓内成血管类祖细胞及相关机制研究-外科学(整复外科)专业论文.docxVIP

上海交通大学医学院博士学位论文 上海交通大学医学院博士学位论文 万方数据 万方数据 局部高密度扩增骨髓内成血管类祖细胞及相关机制研究 摘要 干细胞体外扩增和干性维持是本领域的研究热点和难点，已知体内干细胞特 性维持与自我更新依靠其所处的微环境，其中干细胞之间，以及与周围细胞的接 触与信息交换起着重要的作用，而传统体外干细胞培养方法破坏了细胞间的接触 与信息交换，降低了扩增效率。我们提出了局部高密度细胞接种的设想，通过高 密度接种骨髓细胞的方法来增加细胞之间的相互接触，达到扩增骨髓中成血管类 祖细胞的目的。 目的 本研究旨在通过局部高密度培养增加细胞-细胞间接触，进而达到扩增骨髓 中成血管类祖细胞的目的，并通过基因芯片分析，定量 PCR 等手段，发现并验 证与高密度培养相关的特异性分子，阐明高密度培养扩增并维持成血管类祖细胞 特性的可能机制。该研究将解决骨髓成血管类祖细胞体外扩增难题，并为研究细 胞-细胞接触建立重要的体外研究模型。 方法 我们从 wistar 大鼠的股骨与胫骨中取出骨髓，进行原代培养。原代培养的细 胞消化后，以 2×105/cm2 为密度点状接种直径 10cm 培养皿，均匀分布 6 点接种， 每皿细胞总量 9×105，以相同数量细胞均匀接种于相同大小培养皿作为普通密度 培养对照组。在培养 15 天后，我们通过流式细胞术对传统密度已经局部高密度 培养出的骨髓细胞进行表型的鉴定，并在体外与体内验证了局部高密度培养得到 的细胞与传统密度培养得到的细胞在血管再生能力上的差异。 结果 流式细胞分析结果显示与传统密度相比，局部高密度培养的骨髓细胞与原代 细胞的表型更为接近，高表达 CD14（?????）, CD133（?????）, CD45（?????）, KDR（?????）, CD144（?????）, CD31（???）与 CD34（????）这些与造血 和成血管类祖细胞密切相关的表面标志，显示了局部高密度培养的骨髓细胞可能 具有很强的血管再生能力。 我们通过在 matrigel 上的成管实验证明了局部高密度培养的骨髓细胞在体外 具有更加良好的血管形成能力，结果显示传统密度形成的分支节点数为 7.2 个， 而局部高密度形成的分支节点数为 29.8 个。 我们通过对下肢缺血裸鼠的细胞治疗来证明了局部高密度扩增细胞具有更 好的潜在治疗价值。结果显示下肢缺血裸鼠治疗三周后，局部高密度治疗组能够 更好的改善缺血裸鼠的预后：出现下肢坏死的比例为 30%，作为对照 PBS 组坏 死率为 100%，传统密度组坏死率为 90%。下肢血流改变反映了同样的趋势：高 密度治疗组 3 周后患/健血流比为 0.82，而 PBS 组与传统密度组患/健血流比分别 为 0.4 与 0.53。我们检测了缺血下肢肌肉内的血管密度，结果显示高密度治疗组 的血管密度为 776.9/mm2，而 PBS 组与传统密度组血管密度分别为 400/mm2 与 423.4/mm2。 最后我们通过基因芯片以及定量 PCR 的方法初步探讨了局部高密度扩增骨 髓内成血管类祖细胞的可能机制。实验结果显示局部高密度扩增的细胞高表达整 合素类相关表面分子，整合素类分子与细胞接触密切相关，同时也可以影响细胞 的成血管能力，因此可能整合素类分子的上调在局部高密度扩增成血管类祖细胞 中起到了重要的作用。另外我们发现了在局部高密度培养体系，一些与血管再生 密切相关的生长因子无论在基因还是在蛋白上的表达均明显高于传统密度培养 体系，这提示生长因子的差异也可能是局部高密度扩增成血管干细胞的可能机制 之一。 结论 局部高密度培养大鼠骨髓细胞可以扩增出骨髓中的成血管类祖细胞，这些细 胞具有很强的体内外形成血管的能力并具有很好的治疗缺血性疾病的价值。这些 成血管类祖细胞在局部高密度体系内的扩增可能与整合素相关分子的上调，细胞 外基质相关分子的上调以及成血管类生长因子的高表达有着密切的联系。 关键词：干细胞，细胞-细胞接触，局部高密度培养， 血管再生 Expansion of bone marrow proangiogenic cells by high density dot culture and the related mechanisms ABSTRACT Background—Adult stem cells are distributed in various tissues and their stemness is maintained by the stem cell “niche”. Mimicking the niche in vitro remains a great challenge. Growing evidence suggests that cell-cell i