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实验二 血清分离（眼球取血） 脾细胞制备(吹气球法) 溶血空斑试验 血清分离 眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-0.1mL。 【操作方法】 眼球采血将血液保存于1.5mlEp管中， 4 ℃静置24H 10000rpm/10min，收集血清； -20℃保存待抗体水平检测。同时采集正常小鼠血清作为对照。 小鼠B细胞溶血空斑形成试验 溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外试验方法，经典的试验是用于检查动物的抗体产生功能。 将绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合，在补体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要用于测定B细胞抗体产生能力。 【试剂与器材】 1. 健康小鼠（约18～20 克重）。 2. 绵羊红细胞悬液（2.5%）。 3. 指示细胞悬液： 含10% 绵羊红细胞悬液 0.5ml，补体（即新鲜豚鼠血清）0.3ml， Hank′s 液2.0ml。 4. Hank′s 液（pH7.2）。 5. 动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、中 试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、 6. 盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。 【操作方法】 免疫动物 取2.5% 绵羊红细胞悬液2ml，无菌操作注射于小鼠腹腔内。（4 天后追加一次免疫效果更佳）。 见试验一，已做 制备脾细胞悬液 1.将免疫后7 天的小鼠颈椎脱位处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上； 2.在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏； 3.在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks 液的培养皿中； 4.左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用5ml 的注射器抽取平皿内液体(4～５ml)缓缓注入脾脏内，将脾细胞冲洗出来。如此反复冲洗，到脾脏变白为止。 5.用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用少量Hank′s 液冲洗脾脏及平皿内残留的细胞，移入试管内。离心1000 转/分5～ 10 分, 弃上清，加5ml 冷红细胞裂解液（NH4Cl 3.735g/450ml 双蒸水+Tris 1.3g/50ml 双蒸水pH7.65），将细胞离心管插入碎冰中，每2 分钟摇动1 次，裂解10 分。离心（1000转/分）5～10 分。弃上清，用Hank′s 液洗2 次，离心（1000 转/分）5～10分钟。弃上清。用Hanks悬浮细胞，调细胞浓度到2×l06/m1。 6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸取此悬液0.1ml 放小试管中，再加0.9mlHank′s 液，即为500 倍稀释的脾细胞悬液。 眼球取血 → 处死小鼠 → 取脾→用10ml洗液冲脾→离心2000r/min 8min→弃上清，加裂解液2ml，混匀，2min后离心（转数、时间同上）→弃上清加洗液10ml，混匀，离心（同上） 弃上清加4.9ml洗液混匀 取0.1ml脾细胞悬液+0.9ml洗液（A液），混匀 取0.1ml（A液）+ 0.1ml指示系统，混匀 取50ul加入玻片小室（约用30ul） 细胞计数板（Hemacytometer） 血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。 计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。 示意图 细胞计数板的使用 红细胞计数 加样 10ul 细胞悬液 玻片小室的制作 取洁净的载玻片按下图贴二条宽约5mm 和一条10mm 的双面胶，然后用小镊子取 二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室， 用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。 细胞混悬液的配制及灌注 1.取小试管一支，用1ml吸管取0.2ml指示细胞悬液；0.2ml 500倍稀释的脾细胞悬液，混匀后即为被检的细胞混合悬液。 2.用100μl的微量进样器吸取被检细胞混合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两个小室