传代培养直和细胞计数.pptVIP

细胞传代培养及细胞计数 人癌细胞系传代培养 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消化液； 4. 消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液, 保留约0.3ml,室温放置3～5min； 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园, 加1～2ml含血清培养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫； 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱和湿度条件下培养。 注意事项 细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,开始传代。 首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。 细胞混杂生长时, 可根据需要选择合适的方法纯化细胞。 血球计数板法 制备细胞悬液：细胞密度＞104/ml, 细胞过多时需适当稀释,单个细胞率95%。 加样：混悬细胞，取少许细胞悬液，从计数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。 计数：10倍物镜下计数四角大方格内的细胞，压线者只计左边线和上边线。 计算：细胞数/ml=（四大格细胞总数／4）×104×稀释倍数 细胞活力测定－台盼蓝染色法 制备单个细胞悬液：105～106／ml 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 计数：用血细胞计数板镜下