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淋巴细胞的分离与培养 杨 星 淋巴细胞的分离 人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 密度梯度离心法 原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 （一）Ficoll分层液法 Ficoll为合成性蔗糖聚合物的商品名，无毒，但高浓度溶液往往不等渗，且粘性高，易使细胞聚集。 组成：2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1份泛影葡胺生理盐水 Ficoll分层液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。 分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳 。 别名：淋巴细胞分离液 实验方法 1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2） 3. 20℃，1500r/min，离心30min 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。 5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。 7.适量的培养基重悬细胞 ，计数。 分离单个核细胞纯度为95%。 淋巴细胞约占90%～95%。 （二）Percoll分层液法 PBMC悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细胞和血小板。 那么怎样获得高纯度的淋巴细胞及其亚群呢？ 淋巴细胞及其亚群的分离 (一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。 (三)单核细胞和粒细胞的去除 1．粘附去除法 原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 2．羰基铁粉吞噬法 原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。 方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。 方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3．苯丙氨酸甲酯去除法 ?原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。 ?用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。 ?该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 （四）、淋巴细胞亚群的分离 原理：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。 常用方法： （1）E花环分离法 （2）尼龙纤维分离法 （3）流式细胞术 （4）磁珠分离术 （5）亲和板结合分离法 (1)E花环分离法 原理：人类T细胞表面上有能与绵羊红细胞相结合的受体（E受体，CD2）,能与经溴化二氨基异硫基异硫脲氰化物（AET）处理的绵羊红细胞结合，形成稳定的、细胞体积和比重较大的E花环。 方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加入分层液→T细胞形成E花环而沉于管底→悬液中为B细胞。 （2）尼龙纤维分离法 原理：B细胞在37℃时易粘附于尼龙棉（聚酰胺）纤维上，而T细胞不具此能力。 方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管→洗脱下来的是T细胞。 （3）流式细胞术 又叫荧光激活细胞分离仪 (nuorescence activated cell sorter, FACS )法原理： 细胞经荧光染色