构建RFP在宿中的表达载体并表达蛋白2.pptVIP

* RFP 579bp Lgpd1:1056bp IRES-Hygromycin-Termiator:1000bp * 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物. * 一般真核mRNA的翻译都需要5‘帽子来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5端具有一段较短的RNA序列（约150-250BP），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）。 IRES能招募核糖体对mRNA进行翻译。将IRES与外源cDNA融合，发现IRES能独立地起始翻译。 IRES不仅存在于RNA病毒中，在很多DNA病毒中也频繁出现，且在哺乳动物、植物以及酵母中均发现了IRES序列存在，但不同的IRES在功能机理上有一定差异。　　 * * 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。 前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。 后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 * 潮霉素筛选机理：潮霉素B是一种常用的抗性筛选药物，其抗性基因表达产物是一个蛋白激酶，通过磷酸化潮霉素B使其丧失活性，由于在真核和原核生物中潮霉素B筛选假阳性率低，重复性好，现在通过潮霉素B对转基因生物进行筛选已经在实验室被广泛选用。 * * 《现代生物实验技术原理与技术》学生研讨展示 已有一原核表达载体pCR2.1、RFP蛋白编码基因、以及真核表达宿主Lentinus edodes，构建RFP在宿主中的表达载体并表达蛋白。 课题 实验思路 pCR2.1 cut link Target Sequence Origin Vector Vector Host Host transfect Protein detected 方案流程 查找载体、宿主信息 查找基因序列 表达载体筛选 载体转染宿主 构建表达载体 设计扩增引物 转染结果筛选 蛋白表达检测 查找载体信息 pCR2.1 TOPO TA载体 查找宿主信息 香菇（Lentinus edodes）是一种重要的药食两用真菌，产量仅次于双孢菇。 1998年，Sato等以香菇原生质体为材料用限制性酶介导法首次成功转化香菇，将外源基因组整合到香菇的基因组中。 2001年，孙丽等采用PEG(polyethylene glycol , 聚乙二醇)介导法在我国首次建立了香菇遗传转化体系。 2008年，Kuo等建立了香菇电击法遗传转化体系。 2009年，喻义赣等建立了香菇根癌农杆菌介导的遗传转化研究体系。 RFP基因序列查找 Addgene 红色荧光蛋白(Red?Fluorecent?Protein,RFP)基因是从海葵Discoso-masp中分离出的一种新的荧光蛋白基因,其蛋白质的最大吸收光谱为583?nm，不需要任何预处理便可检测到。红色荧光蛋白因其红荧光较强的组织穿透力，已被广泛用于动物、植物和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因。 启动子序列查找 题目要求网络搜索L. edodes beta-肌动蛋白启动子和终止子，但我们没能检索到任何信息，故改用其他启动子。 在香菇中较为常用的启动子主要有两种：ras基因的启动子和gpd基因的启动子。我们选用了香菇自身的gdp强启动子，因为相比ras，gpd能更有效地驱动外源基因的表达。 根据己发表的香菇gpd启动子序列(郭丽琼等2007)，选择活性最强的Lgpd1启动子，并相应设计引物。 潮霉素抗性基因序列查找 通过网络搜索我们获知： 在piggyBac