地黄AuxIAA家族基因RgIAA1克隆与表达研究.docx

地黄Aux/IAA家族基因RglAAl克隆与表达研究 ［摘要］为了克隆地黄Aux/IAA家族基因RglAAl,分 析地黄RglAAl的时空表达特性及对逆境胁迫的响应。以拟 南芥AtIAA14的cDNA序列为探针在地黄转录组数据库中进 行比对，应用生物信息学方法分析RglAAl的序列特征及进 化关系，以实时荧光定量PCR技术检测RglAAl在地黄不同 组织以及逆境胁迫下的表达量。结果表明，获得1条903 bp 的cDNA序列，包含一个681 bp完整的开放阅读框(0RF), 编码226个氨基酸，具有Aux/IAA家族蛋白的典型结构域和 特征序列。RglAA 1在地黄不同组织中的表达呈差异表达，其 中在地黄幼嫩叶片里表达强度最大，其次为茎，且随着叶片 的伸展，RglAAl表达强度不断降低。在连作时RglAAl的表 达量升高，NaCl和渍水胁迫下RglAAl的表达量降低。实验 首次克隆了地黄Aux/IAA家族基因RglAAl,为阐明其在地黄 生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。 ［关键词］地黄；Aux/IAA家族基因；序列特征；表达分 析 地黄Rehmannia glutinosa L为玄参科多年生草本植 物，以块根入药，为著名的四大怀药”之一。随着分子生 物学技术的快速发展，地黄的基因信息解析逐渐成为研究的 热点。然而迄今为止，地黄基因克隆的报道较少，有肌动蛋 白基因片段⑴、RgPR210基因⑵、转座酶基因［3］、扩展蛋 白基因RgEXPAl［4］和3-酮酯酰CoA-硫解酶基因RghKAT［5］ 等。 生长素可直接作用于细胞膜或细胞内组分，参与植物整 个生命周期的生长发育调控。生长素的信号转导途径包括信 号识别、生长素相关基因的表达及植物表现生理响应［6］。 Aux/IAA(auxin/ indoleacetic acids prot ein)和 ARF (aux in response factor)是生长素信号转导必需的两类转录因子 家族［7］。Aux/IAA在植物中有多个成员组成，如从拟南芥 Arabidopsis thaliana、水稻 Oryza sativa、毛果杨 Populus trichocarpa 和高粱 Sorghum bicolor 中分别鉴定出 29, 31, 25, 25个Aux/IAA基因。Aux/IAA蛋白家族成员多包含4个 高度保守的结构域，结构域I具有转录抑制功能，结构域11 能够维持Aux/IAA蛋白的稳定性，结构域III, IV负责与 Aux/IAA蛋白或ARF蛋白形成同源和异源二聚体［8-9］。薛建 平等［10］检测了地黄不同组织、不同生长时期的IAA含量， 推测IAA调节特异的mRNA合成，促进不定根膨大形成块根。 A1IAA14控制拟南芥的侧根发育［11］,并且参与缺磷响应 ［12］,是一个重要的功能基因。为了研究Aux/IAA基因在地 黄生长发育的分子功能，本研究以A1IAA14的cDNA为查询 序列，应用电子克隆结合PCR扩增技术，克隆了一个地黄 Aux/IAA基因，命名为RglAAlo应用生物信息学和实时荧光 定量PCR方法，分析其序列特征和基因表达模式，为地黄 Aux/IAA基因在地黄块根膨大、活性成分积累以及逆境胁迫 等发育进程中的分子功能研究奠定基础。 1材料与方法 1. 1样品和胁迫处理克隆基因和胁迫处理均选用怀地 黄优良品种‘温85-5”为材料，经河南农业大学高致明教授 鉴定为R. glutinosa。所有实验材料均种植在直径14.5 cm、 高15. 5 cm的聚乙烯塑料盆里，在光照培养箱（LRH-300-G, 广东医疗器械厂）里生长，温度为25 °C,光照强度为2 000? 4 000 lx,光照时数14 ho 实验设置3种处理：①连作胁迫。以至少10年未种植 过地黄的土壤为头茬栽培处理，以上年种植过地黄的土壤为 连作栽培处理。在头茬和连作处理的土壤中种植地黄种栽 （块根），出苗后70 d取叶片用于基因表达检测。②盐胁迫。 以2%的NaCl溶液浇灌头茬土盆栽种植45 d的无菌组培苗， 12h后取叶片用于表达分析。③渍水胁迫。自来水浇灌头茬 土盆栽种植45 d的无菌组培苗，水层高于土表2 cm左右， 连续3 d后取叶片用于表达分析。盐胁迫和渍水胁迫均以未 处理的无菌组培苗为对照。 1. 2RNA提取与反转录从“温85-5”幼苗中提取总RNA。 每个植物样品取材约50 mg,以Trizol提取液（Invitrogen,上海）提取地黄总RNA,提取方法参考说明书进行。反转录 采用反转录试剂盒（Invitrogen,上海），用于cDNA第一 链合成需要 3 ug 的 RNA, 0.5 ug 的 Oligo （dT） 12-18 引 物,RNase抑制剂，M-MLV