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流式鉴定细胞表面标记物实验步骤 【实验流程】 一 ?前期样品准备 二?上机前样品的处理 三?流式细胞仪检测 四?流式检测数据分析 【具体步骤】 一 ?前期样品装备 MCF-7贴壁细胞的CD44+呈现低表达，可以不需要鉴定该细胞的CD44和CD24 了。但是可以 接种一孔的MCF-7 DMSO组作为调节荧光染料PE泄露到FITC通道的补偿参考。但是一般情况 下，PE染料难以染上，故可人为破坏细胞作为阳性对照组，比如加药C60或者用冰冻使细胞死 亡。 MDA-MB-231贴壁细胞高表达CD44+ ,接种一孔的MDA-MB-231 DMSO组作为调节荧光染 料FITC泄露到PE通道的补偿参考。 调整细胞浓度使细胞第二天可以铺满即可。 若是检测悬浮球,也可以按照以上的组别进行设I/O 若是检测悬浮球,也可以按照以上的组别进行设I /O 所以前期样品准备可以按照下表： MCF-7 C60 组 MDA-MB-231 DMS0 组 MDA-MB-231 C30 组 MDA-MB-231 DMS0 组 MDA-MB-231 C40 组 MDA-MB-231 C50 组 注：画〃一为调补偿专用，其余为实验组，为避免细胞数目不够,实验组可以设置两个复孔。 二上机前样品的处理 （一）实验步骤 1?消化收集旧培养基并离心用于终止贴壁细胞的消化。贴壁细胞用200uL 0.25%胰蛋白酶消化， 消化5分钟，然后加2mL离心过的培养基终止消化。 离心：800r/min，离心5min ,弃掉上清液。 重悬:加2mL PBS重悬，涡旋成单细胞悬液。将该细胞悬液转移到流式样品管中，离心，弃去 上清液。加300ULPBS重悬细胞。 调补偿组加抗体：要设置同型对照和单染，标记FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组。每组加 相应的抗体5~10uL。 实验组加抗体:每个实验组都要设置同型对照，标记FITC-ISO+PE-ISO组，FITC +PE组。每组 加相应的抗体5~10uL。 加细胞悬液：分别吸取对应细胞悬液50uL于流式管中（此时细胞数至少为lxlO6/mL以上\ 常温避光孵育20mino 孵育完成后，力D2 mL PBS重悬细胞z lOOOr/min,离心5mino 离心后垂直倒掉上清液，再加200uL PBS重悬细胞,进行上机检测。 （二）注意事项 对于悬浮球的处理,第一个步骤略有不同，步骤如下把悬浮球吸到15mL离心管中离心弃上清， 再用0.05%胰蛋白酶消化，消化5min ,然后加4mLPBS终止消化。 样品要做好标记，流式管也做相应标记。 先加入抗体再加样品，保证抗体不会漏加，而且加抗体的短时间内并不容易发生荧光淬灭，故可 以不用避光。 离心后垂直倒掉上清液后倒置在纱布上轻轻按压,吸干管口即可，不可以甩干,不要再进行二次 倾倒，以免将细胞倒掉。 加入抗体和之后的PBS终止抗体反应、PBS重悬等均不可以用移液枪吹打,只能使用漩涡混匀 器来混匀。 6?消化细胞时要让胰酶自然消化，最好不要人工拍打，否则会成片脱落,影响结果的测定。上机前 的细胞最好是单细胞状态,不要粘连,以免对流式细胞仪造成损伤。 上机检测前,用锡纸把流式管包住，避光z加完抗体尽快在半小时内检测完毕,故一次性不要处 理太多样品,以免发生荧光淬灭。 BD流式抗体过期两年内若是荧光强度仍较好，还可以使用。 三?流式细胞仪检测 ㈠开机 1.开电脑 1. 开电脑，开软件，放置一管ddH2O在上样处 2.开启机器，仪器自动执行Startup,时间大约5min ,直到每秒瞬时的收集信号低于10 ; 2. Startup 完成后,仪器状态显示Cytometer Connected and ready n C6 ind 二 C6 ind 二Row corroded an￡ rudy ? BDAccuriMC6Collectin 11 BDAccuriMC6 Collect in 11 C? Crt?Ur ?o, toutled 推荐上样前运行dd H2O 15min ; （二）设定门 先用同型对照组进行样品采集在A02孔若是细胞群分开不清楚可以调节横纵坐椒即调电压）, 直到分清楚细胞群。 j ?鼠DA File Edit Display Instrument About Set Plot Specs for Plot 2 V6SS§§ QS0-0SPlot 1: A02 B LAN KOO GATE [No Gating]Plot 2:AO2 BLANKOOGATE (Mo Gating]I-AIISlI FSC-A ▼ G 应前Min Value Max Value C log0 500.000 1.000.000FSC-A1.600.000 Q S S59 3%0