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泛素化修饰组学研究昼夜节律的调控机制 题目:Ubiquitylation Dynamics of the Clock Cell Proteome and TIMELESS during a Circadian Cycle 泛素化修饰组学研究昼夜节律调控机制 期刊：Cell Reports 影响因子：032 主要技术：泛素化修饰组学 研究背景： 昼夜节律机制帮助生物个体调整其生理功能以适应外界环境的变化。早期的机制研究多 集屮在转录调控机制基础Z上，随着研究的深入，蛋白水平调控，特别是各种翻译后修饰, 如泛素化，对昼夜节律的调控同样起到了重要作用。 研究结果 泛素化蛋白质组学鉴定昼夜节律相关蛋白 作者利用基于泛素化修饰蛋白质组学的方法，对处于不同时间节点的果蝇头部样木进行 泛素化label free质谱检测分析，每组样本包含三个生物学重复。果蝇头部提取物中的时钟 蛋白质主要来源于视网膜，视网膜具有自己的吋钟基因，而恒定黑暗中的运动活动节律很大 程度上取决于脑时钟网络的小侧腹神经元（sLNv）振荡器。因此，作者将tim +clock细胞的 泛素化组学数据与胚胎神经细胞和成人光感受器的两个泛素化组学数据集进行了比较，发现 在光感受器和时钟细胞屮同时存在91种泛素化蛋口（图lD）o在不同的时间节点Z间的泛 素化修饰的差异蛋白有52个（图1E）,在这些差异蛋白中，一个核孔复合物蛋白MTOR的 丰度变化随着时问的变化尤其显著（图1F）。一般情况下泛素化蛋白丰度的倍数变化集屮在 2倍以下（图1G）,这与哺乳动物肝脏中总蛋白水平的昼夜节律相似。作者对52个候选蛋 白进行分析，发现泛素化蛋白质不均匀相分布，大多数在CT6达到峰值（n = 43）＜,因此，作 者认为，时钟细胞中的蛋白质泛素化集中在白天，而昼夜节律控制的蛋白质合成主要集屮于 CT7 （中午）和CT19 （午夜），以双峰方式呈现。 NeutrAvidin eluates ■?-■■4 !?0 6 12 180 61218tjmbfoub225 kDa150 kDaPERCTc88BirA CT183530252015105 AouenbalJ2 11CT tim0BirAe/av* embryo78116225123tim^ adult head186bioUb-130kDa-PCB-50-130 kDaNeutrAvb dinCT6CTO2OTCSSa suooJd jo JeqEnu1 1.5 ■ ?- ■■ 4 ! ? 0 6 12 18 0 6 12 18 tjmbfoub 225 kDa 150 kDa PER CT c 88 BirA CT18 3530252015105 AouenbalJ 2 11 CT tim 0 BirA e/av* embryo 78 116 225 123 tim^ adult head 18 6 bioUb -130kDa -PCB -50-130 kDa NeutrAvb din CT6 CTO 2 OTCSSa suooJd jo JeqEnu 1 1.5 2 2.5 3 fold change (Iog2) 130 kDa 130 kOa 泛素化蛋口质组学鉴定昼夜节律相关蛋口 MTOR蛋白节律泛素化 为了验证组学结果，作者选择了儿个候选蛋白进行WB验证实验。结果表明，有四个候 选蛋白（HSP83, NRV2, MTOR和SGG）显示出可识别的泛素化，但是只有纯化的bioUb样 品的MTOR免疫印迹结果表现出泛素化节律性（图2A和2B）。为了控制总蛋白水平的可能 节律性，作者选择抗MTOR印迹果蝇头部裂解物，发现蛋白质水平没有明显变化（图20, 这表明MTOR的泛素化程度是受到调控的。MT0R是与NUP153形成核篮的最内核孔蛋白, 它参与细胞分裂的控制并在染色质调节中发挥作用。 为了研究这种调控对节律的影响，作者利用RNAi的技术敲除MTOR,发现敲除导致行 为周期延长并降低节律性的幅度（图2D）。 A Ub-MTOR MTOR 225 kDa CT6 12 180 18tim bioUbbioUbbirAInputNeutrAvidin eluatew Clk-GAL4/Y;; UAS-Dcr^wMepunqB—150 kDa36 9 12 15 18 21MTOROGT—225 kDaw Clk?GAL4/Y; Mtor RNAiKK102690/+; UAS-Dcr^t=25.2w Clk?GAL4/Y;; UAS?Dcr?2/Mtor RNAi HMS00735r=26.5t=23.5DDII0EH 111UHill15 CTCT 0 12JIIIUIIIIIMIBlII H【IHINIBIMIIJINIBIBICBII