Luciferase报告基因系统.pdfVIP

Luciferase 报告基因系统 Luciferase 报告基因系统是以荧光素(luciferin) 为底物来检测萤火虫荧光素酶 (fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在 luciferin 氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence) 。然后可以通过荧光测定仪也称化 学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin 氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧 光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的 基因启动子区DNA 相互作用的一种检测方法。 实验原理： 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用 因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用 元件，转录因子的DNA 结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或 增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay ）是检测这类转录因子和其靶启动子 中的特异顺序结合的重要手段。 其原理简述如下： （1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒， 如pGL3-basic 等。 （2 ）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染HEK293T 细胞或其它相关 的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达 量与转录因子的作用强度成正比。 （3 ）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强 度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。 Luciferase 原理示意图 基本实验步骤： ‐ 1 ‐    1、实验第一天，消化并接种细胞（根据具体实验选择合适的细胞）于35 mm 细 胞培养皿，置于5 ％ CO2 、饱和湿度的37℃培养箱内培养过夜。 2 、等细胞密度达到70 ％ 时用Luciferase 报告基因质粒、LacZ 的表达质粒及其 它质粒（根据具体实验确定）共转染细胞（根据具体实验选择转染方法，如 磷酸钙沉淀法、PEI 、lipofectamine2000 等均可）。 3、转染24 －36 小时后，吸去培养液，用冰冷的PBS 洗涤细胞。 注：荧光酶的酶促反应会被痕量的钙所抑制，故用磷酸钙转染的细胞在收集细胞前应充分洗 涤除去含钙介质。 4 、在每个培养皿中加入350 μl 预冷的harvest buffer,于4 ℃ 或冰上放置10 min 裂解细胞。 5、在细胞裂解期间，准备足量的1.5 mL 微量离心管，将ATP buffer 与luciferin buffer 以1：3.6 比例混合成反应液后分装，每管100 μl 。 6、依次取等体积的细胞裂解液（100 μl ）至步骤5 中的离心管中，迅速混匀，在 发光仪（Luminometer ）上读取吸光值。 注：发光反应会迅速衰减，将细胞裂解液加入反应液后5 秒内必须读取吸光 值。 7、确保以相同操作手法读取全部样品吸光值后。 8、取剩余裂解液测定LacZ 的活性，其读数作为内标用以矫正荧光素酶的读数。 9、用矫正后的读数作图，分析数据。 注：荧光素见光易氧化，已稀释未用的荧光素应丢弃。 实验试剂： （1）harvest buffer (25 ml) ： 1.25 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 25 μl 1 M DTT, 250 μl 10% Triton X-100, 加水 至25 ml ，4 ℃ 保存。 （2 ）ATP buffer (10 ml) ： 1.25 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 250 μl 1 M MgCl2, 24 mg ATP, 加水至10 ml -20℃ 保存。 （3 ）luciferin