qRT-PCR和WesternBlot常见问题解决-李晔.pptxVIP

qRT-PCR和WesternBlot 常见问题解决 实习生：李晔 CONCENT 1 qRT-PCR基本内容 2 3 qRT-PCR常见问题解决 4 WesternBlot常见问题解决 WesternBlot基本内容 qRT-PCR基本内容 qRT-PCR基本内容 定量PCR（即时聚合酶链锁反应，Real-time Polymerase Chain Reaction，简称 Real-time PCR、即时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 Q-PCR/qPCR/RT-qPCR），是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法技术。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。 qRT-PCR基本条件 荧光定量PCR仪 与之相连的计算机 从样品中 提取总RNA 将RNA逆转 录为cDNA qRT-PCR 扩增 定量结 果分析 qRT-PCR基本流程 定量引物设计要求 以MDH1为例，首先在NCBI Nucleotide中搜索基因 每个基因都有不同的转录本，任意选择其中一个适合的转录本 找到CDS序列并复制，不同转录本CDS序列位置不同 将CDS序列复制到引物设计软件Primer5 根据CDS序列设计引物，Tm值为60至64，GC含量40% 到60%，且found少或没有，长下游扩增长度为100到150。 引物设计完后BLAST预测引物特异性 预测引物是否跨内含子 定量结果分析：扩增曲线 扩增曲线 样品放置 定量结果分析：扩增曲线 率先到达CT值得RNA浓度较高，模板较好，内参的CT值一般为10到16之间。 定量结果分析：溶解曲线 单一峰引物特异性较好 出现杂峰引物需要重新设计 qRT-PCR常见问题解决 无CT值（信号）出现 1.反应循环数不够。 一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。 2.检测荧光信号的步骤有误。 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 3.引物或探针降解。 可通过PAGE电泳检测其完整性。 Quantion 1 4.引物或探针的设计。 探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。 5、模板量不足。 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 6.模板降解。 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 Quantion 2 CT值出现过晚 1 2 3 扩增效率低，反应条件不够优化。 设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 PCR产物太长。 一般采用80-150bp的产物长度。 标准曲线的线性关系不佳 Quantion 3 1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。 2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。 3.引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。 4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。 1.mix或水被污染。 3.反应过程中探针的降解。 2.引物二聚体的出现。 用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。 用PAGE电泳对探针进行检测。 Quantion 4 阴性对照也出现明显的起飞 4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。 熔解曲线不止一个主峰 Quantion 5 2.引物浓度不佳。 适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。 3.镁离子浓度过高。 适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。 4.模板有基因组的污染。 RNA提取过程中避免DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。 1．引物设计不够优化。 应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 WesternBlot基本内容 WesternBlot基本内容 细胞蛋白提取： 1、细胞4 ℃预冷，PBS清洗2次。 2、配制裂解液 (6cm板) ：PMSF 1.5 μL+cocbtail (磷酸酶抑制剂) 1.5 μL。 3、取150 μL/孔细胞，加入以上裂解液没过全部细胞，冰上放置30 min。 4、用细胞刮将裂解过的细胞全部刮下来，然后转移到1.5 μL EP管中。 5、最大转速离心15 min，取上清。