河南省福氏4c型志贺氏菌毒力因子检测及脉冲场凝胶电泳分型分析.pdfVIP

4e)引起的腹泻病例数有明显上升趋势。本研究选择河南省2002、 flexneri 初步探索该血清型细菌的致病机制和他们在河南省的分子流行病学特点， 为我国的疾病预防控制工作提供重要的背景资料。 志贺氏菌为0．5．0．7×23 gm的短小杆菌，无芽孢，有鞭毛，有菌毛。 清型(包括亚型)。A群：痢疾志贺氏菌，B群：福氏志贺氏菌，C群： a、1 鲍氏志贺氏菌，D群：宋内志贺氏菌。其中B群又分为1 b、2a、2b、 3a、3b、3c、4a、4b、4c等多个血清亚型【¨。 福氏志贺菌4c型于上世纪70年代在前苏联首次被分离。它与福氏 4型多价血清和福氏4型单价血清(7、8)凝集。国际上除1988年来自 前苏联的报道外，关于它的相关信息几乎没有【51。由于我国近年来频繁 发生由该血清型细菌引起的腹泻散发和爆发【9’101，所以急切需要对该细 菌的流行病学特征深入了解，并初步研究其致病机制，为我国疾病预防 控制工作奠定基础。 材料与方法 1实验菌株： 2002年、2003年、2005年(6月．10月)河南各监 测点腹泻病人分离到福氏志贺菌4c型志贺氏菌共l69株。分别为2002 年济源36株，许昌1 源3株，郑州24株，儿6株。 2所用试剂 物技术公司。 DNA 2)琼脂糖，TaqDNA聚合酶、dNTP、2000bp 物工程有限公司。 3)限制性内切酶：Xbal，Notl均购自日本宝生物公司。 SeaKem BioScience 41 Gold琼脂糖购自CambraexRockland公司。 5)蛋白酶K购自Merck公司。 6)SDS购自北京鼎国生物技术发展中心，进口分装。 8)十二烷基肌氨酸钠、溶菌酶购自SIGMA公司。 9)其他相关试剂购自北京化工厂，试剂均为分析纯。 10)商业化分型血清(日本DenkaSeiken公司) 3溶液配制 3．1细菌培养及PCR所需溶液的配制 1)脑心固体培养基：3 000mL，1 水中，完全溶解后，定容至1 21℃蒸汽灭菌20min，室温保存。 2¨00mg／mL溶菌酶 l 0mL 0个离心管中， g溶菌酶用l TE(pH8．0)溶解，平均分装到l ．20℃保存．每取一管室温融化使用，未用完的部分丢弃。 1 EDTA 4．4mL，纯水 3)TBE(O．5×)：Tris1．889，硼酸6．059，O．5M 2200mL。 OOmL 4)1．O％琼脂糖：1g琼脂糖溶于l TBE(O．5×)中，加热完全溶解， 室温保存。 3．2脉冲场凝胶电泳所需溶液的配制 MTris 21．1 1)1 pH8．0：称取149Tris到800mL纯水中，混匀溶解， 000mL，121℃高压灭菌15min。 用浓盐酸调pH到8．0，定容到1 室温保存。 EDTA 2)O．5M pH8．0：称取146．149 力搅拌器剧烈搅拌，加入NaOH颗粒约509左右，溶液变清亮， 5min，室温 调pH值到8，0，定容到1