基于夹心免疫分析的抗体微阵列的构建-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（９）：８３～８８ 基于夹心免疫分析的抗体微阵列的构建 １ １ １ ２ 吕林莉 　刘必成 　朱　颖 　陆祖宏 （１东南大学肾脏病研究所东南大学附属中大医院肾科　南京　２１０００９） （２东南大学生物电子学国家重点实验室　南京　２１００９６） 摘要　目的：建立一种基于夹心免疫分析的抗体微阵列构建的优化方法。方法：将ＭＣＰ１的捕获 抗体点样于修饰后的玻片，标准抗原加样覆盖所点阵列，生物素标记抗体和链酶亲和素ｃｙ３依次 加样孵育，激光共聚焦扫描仪获取图象并进行数据分析。对捕获抗体浓度、封闭液种类、系统可 重复性和定量检测能力、两种因子平行性检测对信号分析的影响及点样后玻片稳定性进行分析 和评价。结果：随着捕获抗体浓度的升高，信号强度逐渐增加；２％ＢＳＡ／ＰＢＳ和５％酪蛋白可作为 本系统的封闭液；所构建系统具有较好的可重复性（组内变异 １．３％，组间变异８．７％）和定量分 析能力（所建立的抗原浓度相对信号强度标准曲线相关系数达０．９９９５）；并实现了两因子的平行 性分析和点样后玻片的稳定性。结论：确立了基于夹心免疫分析的抗体微阵列构建的优化方法， 为进一步构建多因子定量检测抗体微阵列奠定了基础。 关键词　蛋白质芯片　抗体微阵列　免疫分析 中图分类号　Ｑ９３９９１ 　　抗体微阵列（ａｎｔｉｂｏｄｙｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，ＡｂＭ）是重要的蛋 高敏感性以及微阵列分析的高通量性，通过对微阵列 白质组学技术，是以抗体作为捕获分子，以点阵的形式 构建各关键步骤的优化，实现构建可重复性高、保存稳 固定于载体表面，利用特异性的抗原抗体反应实现对 定且具有定量分析能力的抗体微阵列。 靶分子的分析。与传统免疫分析技术相比， ＡｂＭ具有 １　材料与方法 高通量、高敏感性以及样品消耗少的特点，已经逐渐发 展成为平行性的定性和定量检测生物样品中蛋白质分 １．１　试剂与仪器 ［１～４］ 　　单核细胞趋化蛋白（ＭＣＰ１）抗体对（捕获抗体、检 子的重要平台，对生物医学的发展具有重要意义 。 　　然而，由于蛋白质结构的复杂性，易失去天然构 测抗体）和标准抗原购买自ＢＤＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ， 象；单一的生物样本中，蛋白质浓度变化范围较大；许 ＣＡ，ＵＳＡ）；转化生长因子 ＴＧＦｂｅｔａ１抗体对（捕获抗 多重要的蛋白质分子以低丰度存在，因此，蛋白质微阵 体、检测抗体）和标准抗原购买自Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， 列与基因芯片相比，其敏感性、可重复性、检测动力学 ＭＮ，ＵＳＡ）；链酶素亲和素ｃｙ３购买自Ｚｙｍｅｄ（Ｓａｎ 范围以及定量能力等指标若达到临床应用的需要，则 Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）；小牛血清白蛋白（ＢＳＡ）和琼脂 ［４］ 糖购买自Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）；ＭｉｌｌｉＱ超纯水 面临更大的挑战 。目前蛋白质微阵列技术尚未成 ［５］ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）；其他试剂购自上海试 熟，其构建仍需进一步发展和完善 。本研究拟结合 琼脂糖包被玻片载体的高容量性、双抗体夹心免疫分 剂厂；点样仪ＰｉｘＳｙｓ５５００ａｒｒａｙｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， 析的高特异性、生物素链酶亲和素荧光素检测系统的 ＰａｃｋａｒｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）；激光共聚焦芯片扫描仪 （Ｌ