课件：发酵工程制药二.ppt

（三） 提高抗生素的产量 2、增加参与生物合成中的限速阶段基因的拷贝数 反馈抑制(feedback inhibition)是生物合成限速反应的实质，一般是终产物对合成反应某个环节发挥作用的酶活力的抑制，这个环节就是“限速瓶颈”，被抑制的酶就是“限速酶”。 增加酶基因的拷贝数以提高限速酶的的浓度是增产的基本措施； 天蓝链霉菌十一烷基灵红菌素的生物合成最后一步的0-甲基转移酶、泰乐星生物合成的最后一步的0-甲基转移酶，增加这个酶基因的拷贝数可以提高终产物的产量。 异青霉素合成酶(Isopenicillin N Synthetase, IPNS)的基因与酰基转移酶基因紧密连锁，可能是青霉菌(Penicillium sp.)青霉素生物合成的限速酶； 青霉素N做为头孢菌素C的中间产物，它的积累使头孢菌素C产量下降。说明扩环酶基因cefEF属于限速酶 ； （三） 提高抗生素的产量 3、发挥调节基因的作用 抗生素生物合成基因簇中存在调节基因，以精细调节整个基因簇成员的表达强度； 增加正调控基因拷贝数可以增加抗生素的产量； 降低负调控基因的活性也可以提高抗生素的产量； 天蓝色链霉菌(S. colicolor)的放线紫红素(actinorhodin)生物合成基因簇成员act Ⅱ的四个ORFs都是调控基因，对act Ⅰ、act Ⅲ和其它基因起正调控作用；增加act Ⅱ的剂量可以使放线紫红素产量提高20-40%。 act Ⅱ(编码聚酮合成酶 ketosynthase, KS和链长决定子 chain length determining, CLF) ；act Ⅲ (编码酮基还原酶 ketoreductase, KR) （三） 提高抗生素的产量 4、增加抗性基因的拷贝数 有些抗性基因本身就是抗生素生物合成基因簇成员，甚至做为一个合成环节参与抗生素的生物合成； 抗性基因先于生物合成基因表达，即在建立抗性后，抗生素生物合成基因才能表达、合成抗生素； 抗性基因表达的强度和体现的抗性水平与抗生素合成水平呈现平行关系：如果提高抗性水平就可以提高抗生素合成水平； 氨基糖苷类抗生素抗性基因aacA(编码6’-N-氨基糖苷乙酰转移酶)，增加这个的拷贝数可以提高新霉素和卡那霉素的生物合成量； 1、将产生菌基因随机克隆到原菌株直接筛选高产菌株 2、增加参与生物合成种限速阶段基因的拷贝数 3、发挥调节基因的作用 4、增加抗性基因的拷贝数 提高抗生素的产量的主要措施 （四）改善抗生素组分 许多抗生素产生菌可以产生多组分抗生素，由于这些组分的化学结构和性质非常相似，而其生物活性却相差很大，这给有效组分的发酵、提取和精制带来很大不便。 应用基因工程方法可以定向地改造抗生素产生菌，获得只产生有效组分的菌种。 用阿维菌素B2a生产伊维菌素，产同时产生8个组分，4个主要组分A1a、A2a、B1a、B2a和4个次要组分A1b、A2b、B1b、B2b。A与B组分的区别在于C-5的羟化基因上是否连有甲基，这是由5-O-甲基转移酶基因（aveD）决定。 选育只产生阿维菌素B2a组分的菌种是非常有意义的。为此，至少要引入3个突变。 （五）改进抗生素生产工艺 传统方法往往只能改变最适操作条件、降低细胞生物速率或密度来提高供氧水平。 利用重组DNA技术克隆血红蛋白基因到抗生素产生菌中，在细胞中表达血红蛋白，可望从提高细胞自身代高功能入手解决溶氧供求矛盾，提高氧的利用率，具有良好的应用前景。 将丝状细胞——透明颤菌的血红蛋白基因克隆到放线菌中，可促进有氧代谢、菌体生长和抗生素的合成。 这一血红蛋白含有两个亚基和146个氨基酸残基，相对分子质量为1.56×105。 生物合成途径中某个酶基因的突变 在生物合成途径中引入一个酶基因 利用底物特异性不强的酶催化形成新产物 （六）产生杂合抗生素 有针对性地对某些基因进行操作，如替换、阻断、重组等均有可能改变其生物合成途径而产生新的代谢旁路，形成新的化合物。 组合生物合成的基本过程是将不同来源的基因组合，在异源宿主细胞中进行基因表达，将宿主细胞产生的化合物分离提纯，对化合物的结构进行解析，推测生物合成规律。 组合生物合成的特点 （七）组合生物合成 二、基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用㈠ 在氨基酸生产中的应用 以 E. coli 为主的基因工程技术的应用：充分利用氨基酸合成操纵子的调控成分，如弱化子(attenuator)缺失、阻遏物基因突变、解除反馈抑制(限速反应)等； 酶法生产氨基酸工艺中，主要是通过克隆某些酶系基因来生产氨基酸。如，把色氨酸合成酶基因与丝氨酸转羟甲基酶基因与质粒载体重组，转化大肠杆菌，用于酶法生产L-色氨酸。 又如，L-苯丙氨酸生产中的三种重要的转氨酶基因aspC、tyrB、ilvE，都可以与质粒载体重组转化大肠杆菌，用于提高酶法生产L