课件：基因工程的酶学基础.ppt

* * * Klenow 来源： E.coli DNA PolymeraseⅠ经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970) DNApolⅠ 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶 C端(76kd) + N端（36kd） 5’→ 3’外切 Klenow 5’→ 3’聚合 3’→ 5’外切 Klenow 用途 填补限制酶的5′-粘性末端为平齐末端 5’…CC 3’…GGAATT 5’…CCTTAA3’ 3’…GGAATT5’ Klenow 3′-末端标记：Klenow 在无底物时只进行3′→ 5′外切；有底物存在时则聚合。 这种标记也称作交换标记，但Klenow作用不如T4DNA聚合酶。 T4DNA聚合酶 来源：T4Phage感染的E.coli 结构：MW=114，000d 活性： 5′→3′聚合活性； 3′→5′外切活性，对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比Klenow大200倍 用途 填补或标记限制酶切后产生的5′-粘性末端的3′-凹缺末端。（同Klenow） 3′-粘性末端的标记制备DNA探针,同 Klenow 末端标记。  T7DNA聚合酶（测序酶） 来源：T7Phage感染的E.coli 结构：由2个蛋白亚基组成： T7phage gene5蛋白 + 宿主硫氧蛋白 活性： 5′→3′聚合，持续反应时间最长，所以合成的DNA链长。故在DNA测序中很优越。 3′→5′外切，是DNA 聚合酶Ⅰ的 1000倍。 用途 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列 用填补或交换反应快速进行末端标记。 与T４DNApol一样，平齐粘性末端。 定点突变中互补链的合成。 5′ 3′ 3′ 5′ 修饰的 T7DNA 聚合酶(测序酶) 来源： 天然 T７DNA聚合酶经修饰处理 结构：同T７聚合酶。 用还原剂、分子氧、低浓度 Fe２+与酶保温几天，可使PhageT7 gene5蛋白N-端3′→5′外切酶活性中心失活(O- 修饰)。即：5′→3′聚合酶作用提高，持续性长。3′→ 5′外切作用下降99%以上。 Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus) 来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种 结构：单亚基MW=94000d。 活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3′→5′外切酶活性，具5′→3′外切活性 。 用途： PCR反应。 测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。 DNA聚合酶Ｉ缺陷的突变株仍能生存，表明DNA聚合酶Ｉ不是复制的主要酶。 1970年， DNA聚合酶Ⅱ，分子量120KDa。 特点： 5’ → 3’的聚合酶活性；作用于双链DNA分子中有空隙（gap）的单链，gap不长于100个核苷酸 3’ → 5’的外切酶活性 无5’ → 3’的外切酶活性； DNA聚合酶Ⅱ DNA聚合酶Ⅲ是细胞内DNA复制的所必需的酶。 DNA聚合酶Ⅲ由多个亚基组成（αεσδβ） 特点： 5’ → 3’的聚合酶活性；作用于双链DNA分子中有空隙（gap）的单链 3’ → 5’的外切酶活性 5’ → 3’的外切酶活性； DNA聚合酶Ⅲ 反转录酶（reverse transcriptase） 来源：商品反转录酶有两种 来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。 来自能表达Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的E.coli。 结构和活性： 酶类别 肽链 5’-3’聚合活性 RNAseH AMV α62，000 β94，000 + +++ M-MLV 84，000 + + 用途： (1) 5’ 3’ 聚合酶活性, 能以RNA或DNA模板合成DNA分子； (2) RNA酶H活性，对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了在反转录完成后再用NaOH降解RNA模板的步骤。 (3)用于３’凹陷末端的标记，杂交探针的制备和DNA序列测定．　 cDNA的合成主要步骤： 在某种生物的mRNA分子中，加入引物使之与mRNA退火，并引导逆转录酶按照mRNA模板合成第一链cDNA，产物是mRNA:DNA杂交分子；然后再以cDNA第一链为模板合成cDNA． 磷酸激酶催化5’-OH 加 P （标记） 和磷酸酶去除 5’- P （防止自身环化） PNKase PMase 5′HO A T T A G C ……… C C G T A A T C G ……… G G C OH 5′ 多核苷酸激酶 磷酸甲酯酶 Phosphomonoesterase 5′p A T T A G C ……… C C G T A A T C G ……… G G C p 5′ 磷酸激酶和磷酸酶 重组DNA技术中常用的工具酶 工 具