课件：基因工程中的酶.ppt

* （1）必须是两条双链DNA或DNA-RNA。 （2）DNA3’端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+ 2. 连接条件 * 3.DNA连接酶的基本性质 * DNA连接酶的基本性质 * 连接酶反应的最佳温度是37?C。 三、连接反应的温度 1. 最佳温度 但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。 2. 实用温度 所以一般采用 4~16 ?C。 * 第三 DNA聚合酶 一、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶 * 二、DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I （1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质 ①一条单链多肽。 ②5’?3’外切酶活性位于N端。 ③3‘→5‘的核酸外切酶活性 ④ 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 * 大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 * 2. Klenow fragment 用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶 I可以切掉N端的5’?3’外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。具有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。（失去了5’?3’外切酶活性）。 （1）Klenow fragment的性质 * ① 3’端补平 补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。 （2）主要用途 3’ 3’ * ② DNA 3’末端标记 在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 * 3. 逆转录酶 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）： 依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。 来源 RNA肿瘤病毒。 * 逆转录酶的用途 以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。 ① * * 第四、碱性磷酸酶 1. 碱性磷酸酶种类 从大肠杆菌中分离出来。 Bacterial alkaline phosphatase，BAP （1）细菌性碱性磷酸酶 （2）小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP 从小牛肠中纯化出来。 具有抗热性。 SDS中加热68oC可完全失活。 * 其用途是： 除去 DNA 片段的 5 - 磷酸，以防止自身环化。 * 第五、T4多核苷酸激酶 1. 来源 从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。 2. 功能 催化?磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。 不论5’-OH端突出与否。 * 该酶的用途是：① 为化学测序法标记 DNA 的 5 末端； * 小结 1.限制性内切酶：切割 2.DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。 3.DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起作用。　　 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求 * 许多都用作工具 * * * * * 第三节基因工程中的酶学 关键词： 了解各种酶在基因工程中的作用 掌握限制性内切酶和连接酶的基本特性 逆转录酶在基因工程中参与了哪些反应？ * * 重组DNA技术中常用的工具酶 工具酶 功能 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶I 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5‘磷酸基和3’羟基末端之间形成磷酸二酯键，是DNA切口封合或是DNA片段连接 ①合成双链cDNA的第二条链 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3’末端 ①合成cDNA ②代替DNA聚合酶I 进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5’羟基末端磷酸化，或标记探针 在3’羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基 * 第一 限制性核酸内切酶 这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。 * 一、限制性内切酶概念的提出 寄主控制的限制（restriction）与修饰 (modification) 现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障