课件：大肠杆菌表达系统.pptVIP

四、高效表达目标基因的战略和技术 表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。 核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，具体表现为： SD 序列 UAAGGAGG 的翻译效率要比 AAGGA 高3～6倍 翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是 6～8 个碱基长度， 与 AAGAA 的最适距离是5～7 个碱基长度 ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3 ～ 4个碱基，与 AAGAA 至少相隔 5 个碱基； mRNA 的翻译才能进行 ATG 与 SD 序列之间的碱基组成为 A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效 率较高。 核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5’ 端的二级结构，研究表明讨 mRNA 5’端形成的 “茎环” 结构阻碍了 mRNA 与核糖体 30S 亚基的结合，从而抑制了翻译的起始。 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5’ 端形成的 “茎环” 结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR 等技术改变个别关键的碱基来破坏 mRNA 5’ 端的 “茎环” 结构 。 把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个 SD 序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因 5’ 端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下 表达质粒的优化和设计 在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列 能提高 mRNA 翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻译增强子 。 四、高效表达目标基因的战略和技术 共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因 表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因。 现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： 编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG 编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA 编码 Cys 的密码子 UGU、UGC; 编码 Gly 的密码子 GGA、GGG 编码 Leu 的密码子 CUA、CUC 编码 Ile 的密码子 AUA 编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC 编码 Thr 的密码子 ACA 四、高效表达目标基因的战略和技术 共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因 由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的 tRNA 的丰度有正比关系稀有密码子对应的 tRNA 的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。 解决这一问题的办法： 通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子。 在表达系统中共表达稀有密码子 tRNA 基因，以提高大肠杆菌细胞 内稀有密码子 tRNA 的丰度 四、高效表达目标基因的战略和技术 在所有的大肠杆菌稀有密码子 tRNA 中，tRNA Arg (AGG/AGA) 含量最少，而 AGG 和 AGA 密码子在真核基因中经常出现。 人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂 NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子， 在大肠杆菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg(AGG/AGA) 基因 argU 后， 这些基因的表达水平能明显得到提高。 现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA 的二级结构的不同决定了它对翻译过程的影响是有差别的。所有的结论要通过实验才能得出。 四、高效表达目标基因的战略和技术 提高目标基因 mRNA 和目标基因产物的稳定性 由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌中的核酸酶和蛋白水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。 四、高效表达目标基因的战略和技术 蛋白水解酶的特点 细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目标蛋白在细胞质中最容易受