生物药物分析.pptVIP

一般多肽类药物，如胸腺肽,转移因子等由动物脏器提取而来，其检验方法与第八章蛋白质的方法基本相同。这里仅就通过基因重组而得到的多肽类药物加以叙述。 基因重组多肽因子类药物的鉴别主要采用SDS-聚丙烯酰胺电泳法和免疫印迹法。 SDS-聚丙烯酰胺电泳法 SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的非共价键使其成为组成它们的多肽链，并按一定的比例和解聚后的蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质 SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而主要取决于蛋白质及其亚基分子量大小。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。 用SDS鉴别生物样品必须是该品有极纯的标准对照品，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标准品有相同的迁移率，从而鉴别该品。 缺点：必须有标准品，而实际工作中获得生物标准品是十分困难的；凝胶中多肽需保留生物活性，或能够复性，或电泳前可将检测配基与待测多肽共价交联。 免疫印迹法（又称转移电泳，蛋白印迹法，western blot） 原理：借助聚丙烯酰胺凝胶技术，将生物活性物质高效分离，分离后的样品可以原位、定量驱动或吸印在另一种固相载体（通常用醋酸纤维素薄膜，简称NC膜）上，能保持原有的生物活性，可以进行各种生物检测、免疫识别、扫描、积分和保存。 基本操作分3个部分：聚丙烯酰胺凝胶电泳；转移电泳即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸上；检测或鉴定薄膜上的多肽条带。 ①聚丙烯酰胺凝胶电泳 先将待分离样品进行凝胶电泳分离。凝胶可用琼脂糖凝胶，也可用聚丙烯酰胺凝胶，可以是均一的，也可用梯度凝胶，凝胶缓冲体系中可含有各种变性剂，如SDS、LDS、尿素等，可进行单向或双向电泳，也可用等电聚焦电泳。 ②转移电泳 将湿醋酸纤维素（NC）薄膜紧贴凝胶，凝胶与薄膜之间不能有气泡，否则在气泡所在部位的条带将不能转移，在NC膜和凝胶的另一侧放上两层湿滤纸，也不能有气泡，再在两边贴上海绵，最后用塑料网框架夹紧，插入电泳槽，根据凝胶中样品所带电荷的性质，决定有NC膜的一边是靠近正极还是靠近负极一侧。 电泳条件取决于凝胶类型、转移装置和蛋白质本身性质等。一般采用低电压和低电流（2mA/cm2以内）。 缓冲液中一般含有20％的甲醇或乙醇，其作用主要是保持凝胶的几何形状。 ③检测或鉴定 NC膜借助非共价键吸附蛋白质，经转移后蛋白质条带就固定在NC膜上，完全保留凝胶中的蛋白谱，可直接用考马斯亮蓝、氨基黑10B等染色。如果利用蛋白质生物活性，或用蛋白质生物探针来检测，就要先用1％～3％的牛血清蛋白或血红蛋白，或非离子去垢剂（0.3％吐温-20）等处理NC纸，以封闭NC纸上未吸附蛋白质区域，使其不再能吸附蛋白质。使用非离子去垢剂比较经济，但有可能把NC纸上的某些蛋白质洗掉，同时还要将NC纸反复洗涤以去除变性剂，使蛋白质恢复到天然态或生物活性，然后再与检测探针保温。如用Con A（伴刀豆球蛋白A）检测糖蛋白，用抗体检测其特异性的抗原，用激素检测其特异受体，用底物检测特异的酶等。如探针本身具有放射性（如125I标志Con A），或连有酶（如酶标抗体），或荧光探针，那么反应后应彻底洗涤，可立即进行放射自显影，或与底物来反应，或紫外灯下观察荧光。 第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。 第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至醋酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。 第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的醋酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP（辣根过氧化物酶 ）底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了SDS的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无针对病