课件：过氧化物酶.pptVIP

* 双缩脲在碱性溶液中与铜离子（酒石酸钾钠-CuSO4）络合生成复杂的紫红色化合物。 蛋白质分子中的肽键（—CO—NH—）与双缩脲结构相似，也有双缩脲反应，其颜色深浅与蛋白质的含量成正比，因此所有蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，可用作蛋白质定性、定量分析。 * 甲试剂实质是利用蛋白质中肽键反应进行定量测定，它与蛋白质分子量及氨基酸组成无关，即受蛋白质氨基酸的特异性影响较少。但灵敏度较低，mg级水平，0~10 mg/mL作标准曲线。 * 乙试剂：主要起作用是磷钼酸（磷钨酸），它由钼酸钠 （钨酸钠）在酸性（磷酸等）作用下产生。 钼酸钠（钨酸钠） ∣ ↓HCl 碱性 H3PO4 + 钼酸（钨酸） 磷钼酸 钼兰（钨兰） （磷钨酸）还原剂 * H3PO4 + 12H2MoO4 → H3Mo12PO40 + 12H2O 碱性↓还原剂 Mo2O3?MoO3 兰色 * Folin酚试剂最初由Folin等于1912年提出，当时只有乙试剂应用于酚类测定，以后才用于蛋白质测定。因为Tyr的酚基也能起还原剂作用，呈兰色反应，因而被利用于测定蛋白质，产物颜色深浅与被测蛋白质含量成正比关系，所以乙试剂作用是利用蛋白质中Tyr、Try、Cys等具有还原性的氨基酸残基的作用进行测定，灵敏度高，但是后来发现有些缺点，出现不少改良方法。 * 1951年Lowry（劳里）在 Folin酚试剂 中引入双缩脲反应（加入甲试剂）即成为如今广泛被使用的Lowry法。 为什么要作这样改良？ Folin酚试剂中只有乙试剂，依赖蛋白质中Tyr、Trp等氨基酸残基的反应，而对于不同种类蛋白质，由于它们之间的氨基酸组成不同，在呈色反应中就会有差异，影响实验准确度，即受蛋白质特性影响较大，而双缩脲试剂是利用肽键反应，不受氨基酸组成的影响。 * 引入双缩脲试剂后，具有两种试剂双重作用，互相补充，结果大大增加了反应的灵敏度和准确度。Lowry法较双缩脲灵敏度提高100倍，较UV法灵敏10~20倍。 Folin酚（Lowry）法，灵敏度高，操作简单，迅速，不需要特殊仪器，常用作蛋白质定量测定，文献引用最多。 * 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低，适 用于0.2～ 1.0mg/ml 氮，误差为 ?2 ％ 费时 8～10小时 蛋白质（平均含氮 量16％）经过硫酸 消化，强碱碱化， 吸收并滴定，准确 测定氮量 非蛋白氮（可用 三氯乙酸沉淀蛋 白质而分离） 用于标准蛋白质 含量的准确测 定；干扰少；费 时太长 双缩脲法 （Biuret法） 灵敏度低 310nm比色 0.1～1.0mg/ml 540nm比色 1～10mg/ml 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性 Cu2＋?紫色络合 物 硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似 紫外吸收法 较为灵敏 0.1～1.0mg/ml 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸 和色氨酸残基在 280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧 啶；各种核苷酸 用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正 Folin－酚试剂 法（Lowry法） 灵敏度高 0.03～5?g 慢速 40～60分钟 双缩脲反应；磷钼 酸－磷钨酸试剂被 Tyr和Phe还原 硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇 耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化 考马斯亮蓝法 (Bradford法) 灵敏度最高 1～5?g 快速 5～15分钟 考马斯亮蓝染料与 蛋白质结合时，其 ?max由465nm变 为595nm 强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS 最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不同 蛋白质变化 2、蛋白质的定量测定 * 3.比活