转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因克隆及表达.pptVIP

转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因的克隆及表达 制片：何颖 舒冬梅 王惜 韩可以 操作目的： 采用RT-PCR技术，从黑曲霉的菌丝体RNA中扩散出葡萄糖淀粉酶GAT的结构基因，将其转接到pPIC9载体中，转入巴斯德毕赤酵母GS115中，获得重组酵母，使重组酵母中的葡萄糖淀粉酶活增高。 基因载体：pPIC9 操作方法： 1.引物设计，根据已知的黑曲霉葡萄糖淀粉酶一基因序列和表达载体，pPIC9的克隆位点，利用DNAsis设计一对扩增葡萄糖淀粉酶一基因的引物，上游引物为5 ’ -TACGTAGCGACCTTGGATTCATGGTT - - 3’,带有SnaB一位点；下游引物为5 ’ -GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG - 3’,带有Not一位点。 RT-PCR扩增： 首先，黑曲霉保藏菌种经查氏斜面培养基活化后，接种于100ml灭菌的黑曲霉液体发酵培养基中，加少量玻璃珠，200r/min、30℃，培养66~70h,以其为实验材料,利用总RNA提取试剂合提取黑霉的总RNA。再用RNA为模板，以下游引物进行反转录，获得cDNA第一条链。65℃热变性5min，冰浴，然后加入反转录酶，置于PCR仪中，30℃10min，42℃1h，94℃2min。 再以反转录产物为底物，PCR扩增目的基 因，反应条件为94℃3min热变性；94℃30s，54℃50s，72℃2min，40个循环； 72℃延伸10min。 反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶试剂盒回收大约1.9kb的片段。将回收产物连接到pGEM-T载体上，转化DH5a感受态菌，利用α互补法进行阳性克隆的初步筛选。 表达载体的构建: 筛选重组子的示意图 C 转化子的筛选和鉴定（检） 基因工程的操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子 转化子 重组子 目的重组子