石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法.docVIP

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织的采集、固定和保存： 采取组织后， 方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4?C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜 方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis） PBS缓冲液洗三次，每次5min，4?C保存于70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存：： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54?C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10?m，贴于处理过的干净载玻片上，37?C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。 石蜡包埋： 保存于4?C 70%乙醇中的组织样品 ? 80%乙醇 15 min ? 95%乙醇 15 min ? 100%乙醇 15min ? 2 ? 1/2乙醇1/2二甲苯 15 min ? 二甲苯透明 5-10 min ? 1/2二甲苯1/2石蜡 30 min ? 石蜡（1） 1.5hr ? 石蜡（2） 1.5-2.5hr ? 石蜡（3） 包埋 ? RT保存 3、石蜡组织切片的免疫组化方法： 密封保存于RT的组织切片 ? 二甲苯(1) 20 min ? 二甲苯(2) 20 min ? 100%乙醇 20min ? 95%乙醇 10 min ? 80%乙醇 10 min ? 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 ? 切片在PBS中浸泡 5 min*2 ? 0.4%Tritonx RT 10 min ? 切片在PBS中浸泡 5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 0.25%胰酶 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 倾去blocking buffer，勿洗 一抗4?C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3 二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h 切片在PBS中浸泡 5 min*3 DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2） 如果是增强型DAB只要1min即可。 切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s， 玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。 若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久） 脱水85%乙醇 5 min ? 95%乙醇 5 min ? 无水乙醇 5 min ? 无水乙醇 5min ? 二甲苯(1) 10min ? 二甲苯(2) 10min ? 中性树胶封片，室温干燥保存 4、石蜡组织切片的免疫荧光方法： 密封保存于RT的组织切片 ? 二甲苯(1)