冰冻切片制作及染色过程中常见问题及处理.pptVIP

;问题思考;一、冰冻切片的优缺点 ;二、切片制作过程中几个关键步骤;常规HE染色 特殊染色 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色，台盼蓝（肥大细胞）染色 免疫染色(immunol staining) 免疫荧光(immunol fluorescence) 免疫组化(immunol histochemistry) ;1. 动物取材：一定要注意“平行性”;举例：不同实验时间和条件下同种一染色方法结果差异;2. 标本固定应充分 ;减少冰晶的形成 ;3. 切片：组织新鲜非陈旧标本是成败首要因素;保持切片的完整性 ;防止切片卷缩 ;贴片中常见问题及处理 ;贴片方式及标记;4. 染色：抗体孵育和选择: 免疫组化最关键环节;抗体分装和保存;工作抗体的确定;三、 免疫组化结果分析;1.实验分析的相关介绍;用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照 阴性对照还应包括 空白对照：用PBS替代第一抗体 替代对照：用与第一抗体来源的同一动物前血清，来???代第一抗体 吸收实验：用过量的已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部与抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应 抑制实验：待检标本先与未标记的特异性抗体反应后再与标记的特异性抗体染色 ;;只有6，7实验结果有意义 1～5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义 必须重复实验或换用 Ab ;阳性染色特点 定位：胞浆、胞核、胞膜、间质有结构性 染色强度不同：颜色深浅不一 非特异性染色 细胞与组织无区别 弥散性均匀 ; 优秀免疫组化切片: 信噪比高;假阳性示范图;4. 染色失败的几种表现：;;①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。;;（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。 ;最后一个细节：PBS洗液的PH和离子强度;谢 谢！