云芝NADPH-细胞色素P450还原酶在大肠杆菌中表达及-微生物学报.PDF

1156 生 物 工 程 学 报 孙雪娃 等/云芝NADPH-细胞色素P450 还原酶在大肠杆菌中表达及酶学特性分析 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn Jul. 25, 2018, 34(7): 1156−1168 DOI: 10.13345/j.cjb.170517 ©2018 Chin J Biotech, All rights reserved ·研究报告· NADPH-P450 1,2,3 1,2,3 1,2,3 1,2,3 孙雪娃 ，何超 ，方泽民 ，肖亚中 1 安徽大学 生命科学学院，安徽 合肥 230601 2 现代生物制造安徽省重点实验室，安徽 合肥 230601 3 安徽省微生物与生物催化工程技术研究中心，安徽 合肥 230601 孙雪娃, 何超, 方泽民, 等. 云芝 NADPH-细胞色素 P450 还原酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学特性分析. 生物工程学 报, 2018, 34(7): 1156–1168. Sun XW, He C, Fang ZM, et al. Expression and characterization of NADPH-cytochrome P450 reductase from Trametes versicolor in Escherichia coli . Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1156–1168. 摘 要: 云芝Trametes versicolor 具有很强的环境有机污染物降解能力，其烟酰胺腺嘌呤二核苷酸- 细胞色素P450 还原酶 (NADPH-cytochrome P450 reductase ，CPR) 为细胞色素P450 酶 (Cytochrome P450s ，CYPs) 提供电子， 参与有机污染物的降解过程。序列分析显示，云芝基因组拥有 1 个潜在CPR 序列和多个潜在 CYP 序列。为深入 研究云芝 CPR 参与细胞降解有机污染物的分子机制，实验进行了云芝CPR 在大肠杆菌中异源表达和酶学特性分 析。结果表明，经 IPTG 诱导后，去除预测的N 端膜锚定区域 (氨基酸残基 1–24) 的CPR 蛋白 (CPRΔ24) 可在 重组菌中实现可溶性表达，且表达蛋白的分子量与理论值 (78 kDa) 一致。镍离子亲和层析和分子筛层析纯化后 测得其比活性为5.82 U/mg 。酶学性质分析显示，重组CPRΔ24 的最适温度和pH 分别为35 ℃和8.0 ，并对一些 金属离子及有机溶剂具有不同程度的耐受性。酶在 35 ℃、pH 8.0 反应条件下对NADPH 的动力学参数Km 和kcat 分别为 19.7 μmol/L 、3.31/s；对底物细胞色素c 的动力学参数Km 和kcat 分别为25.9 μmol/L 、10.2/s。以上研究为 探究云芝CPR 在环境有机污染物降解途径中的功能机制奠定基础。 : 云芝，NADPH- 细胞色素P450 还原酶，大肠杆菌，异源表达，酶学特性 Received: December 25, 2017; Accepted: February 8, 2018 Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos.. Corresp