汉逊酵母表达乙肝表面抗原的结构研究-中国医药生物技术.PDF

中国医药生物技术 2009 年 12 月第4 卷第 6 期 Chin Med Biotechnol, December 2009, Vol. 4, No. 6 441 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2009.06.008 ·论著· 汉逊酵母表达乙肝表面抗原的结构研究 * * 刘闯 ，朱亭玉 ，李津，王钊，马锐，王曦，尹长城 【摘要】 1 材料与方法 目的 解析汉逊酵母表达重组乙肝表面抗原（HBsAg ）的空 1.1 材料 间结构，给出其颗粒大小、结构对称性方面的信息。 1.1.1 试剂 Tris 碱、HCl 、KCl 购自美国 Sigma 方法 整合 adr 亚型 HBsAg 的基因到汉逊酵母染色体 公司；醋酸铀、纯碳膜铜网购自北京新兴百瑞技术 上，建立重组汉逊酵母菌。经过发酵扩菌、诱导表达、精制 有限公司；牛血清白蛋白（BSA ）、BCA 蛋白浓度 纯化等步骤得到纯化的 HBsAg 。滴加 5 μl 浓度为 80 μg/ml 测定试剂盒购自美国 Pierce 公司。 HBsAg 溶液到亲水处理的纯碳膜铜网上，用 2% 醋酸铀染 1.1.2 仪器 JEOL-1230 透射电子显微镜为日本 色，放置 24 h 后，通过透射电镜得到汉逊酵母表达 HBsAg 电子公司产品；1 k × 1 k CCD 图像传感器为美国 颗粒的二维电镜图像。运用 EMAN 软件包完成图像选择、 Gatan 公司产品；高速冷冻离心机 TL-100 为美国 颗粒框取、颗粒全同性处理、初始模型构建和结构精修等 Beckman 公司产品；U2010 分光光度仪为日本日 HBsAg 重构步骤，获得 HBsAg 颗粒的三维结构。 立 HITACH 产品；DYY-7C 型凝胶电泳仪为北京 市六一仪器厂产品。 结果 汉逊酵母表达 HBsAg 颗粒大小服从高斯分布（P = 1.2 方法 0.45 ），均值为（28.4 ± 2.6 ）nm ；汉逊酵母表达 HBsAg 是 一中空的“鱼笼”状结构，蛋白亚基分布在球状结构的表面； 1.2.1 重组乙肝表面抗原的构建 编码 adr 亚型 蛋白的表面分布大小为 1 ~ 2 nm 的孔状结构和围绕孔状结 HBsAg 的 DNA 序列由 TaKaRa （大连）公司合成， 构的突起；不具备八面体对称性。 由北京天坛生物制品股份有限公司将其电转到汉 逊酵母细胞（Hansenula polymorpha ）体内[10] ，建 结论 汉逊酵母表达的 HBsAg 与血源性的 HBsAg 在大 立 rHadrHBV404 株重组汉逊酵母菌，主要特点是 小和结构对称性方面都有显著差异。 通过甲醇氧化酶调节型启动因子控制 HBsAg 的 【关键词】 毕赤酵母； 肝炎表面抗原，乙型； 负染 表达。酵母菌在发酵扩菌过程中主要包括生长时 色； 显微镜检查，电子，透射 相、去阻遏时相和诱导表达时相三个时间段。 中国医药生物技术, 2009, 4(6):441-444 1.2.2 重组乙肝表面抗原的纯化 通过甲醇诱导 表达 HBsAg ，收获