课件：酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生.ppt

例如： 首先用盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象被破坏，通过透析除去变性剂后，在不同的温度条件下，使酶重新构建新的空间构象。 结果表明：在20 ℃的条件下重新构建的胰蛋白酶与天然酶的稳定性基本相同，而在50 ℃的条件下重新构建的酶的稳定性比天然酶提高5倍。 一、工具酶 限制性内切酶 II型酶的识别序列通常为4-6bP，具有回文结构，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5’或3’末端突出的粘性末端(sticky end)。 GAATTC DNA连接酶 DNA聚合酶 末端脱氧核苷酰转移酶 二、载体 外源DNA本身没有自主复制能力，导入宿主细胞后不能随宿主细胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA导人宿主细胞进行扩增成表达，就需要外源DNA与某种能在宿主细胞中进行自主复制和表达的DNA重组，并由其携带进入宿主细胞。这种可以用来插人外源DNA片段构建重组DNA分子，并将外源DNA携带进人宿主细胞的DNA称为基因克隆载体，简称为载体(Vector)。 三、基因突变技术 根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。 位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。 1．编码基因的专一性位点突变 专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。 (1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 DNA模板的制备； 寡核苷酸突变引物的设计和选择； 突变引物与模板DNA的退火和延伸条件； DNA聚合酶的选择； 底物对离体DNA合成反应的影响； 受体细胞对突变体的产率的影响。 ① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 ① Kunkel 突变法 当E.coli发生dUTP酶缺陷突变时(dut-)，由于这类细胞不能把dUTP转化为dUMP ， 所以细胞内的dUTP量大为增加，其中一些dUTP可以搀入DNA正常情况下由胸腺嘧啶占据的位置。 正常情况下， E.coli可以合成一种尿嘧啶-N-糖基化酶（ung），它可以去除搀入到DNA中的尿嘧啶。 然而，当E.coli为ung-时，该酶失活，故尿嘧啶不能从DNA链中剔除，使细菌DNA中尿嘧啶含量增加。 在dut- ung- F’菌株中，这个比例有所提高。从而使得生长于这一菌株的M13噬菌体的DNA中将含有20-30个尿嘧啶。 先把想要诱变的质粒放到一个ung-突变型的E.coli里，做出一个T全部被U代替的单链DNA的“模子”，然后把这个模子和核苷酸一起放到适宜条件下培养（ATP、聚合酶等）。 放进去的核苷酸除了想要诱变的位点以外，其它全和模子是碱基互补配对的，在DNA连接酶的作用下就会产生一个杂交的双链DNA，一条是模子，一条是定点诱变的产物。再把这个双链DNA放到ung+细菌体内让它把模子酶解掉，再以诱变产物为模板生产质粒，就得到了很多很多诱变过的质粒。。。 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 pALTER-1质粒的特征： 多克隆位点； 含有四环素抗性（Tetr）和氨苄敏感性（Amps） 利用辅助噬菌体超感染, 制备含目标基因的单链DNA作为突变模板DNA。 ③基于去除特定限制性酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 利用PCR方法在基因的5‘或3’末端区产生突变。 该方法是利用PCR反应中，寡核苷酸引物序列被搀入到所产生的DNA分子的末端。所以，只要引物3‘端核苷酸序列能足够好地与模板序列相匹配，引发PCR反应，我们就可以改变引物上5‘端的序列。 重叠延伸和基因突变（中心区产生突变） 利用PCR技术在目标基因的中心区段引入位点特异性突变和产生重组DNA分子。 当将重组延伸方法用以将不同的基因进行剪接和组合在一起时，称为gene SOEing，即通过重叠延伸进行剪接（splicing by overlap extension）。 利用上述原理，可以通过重叠延伸PCR技术对基因的中心区段进行取代、插入和缺失突变。 基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段取代法(DNA fragment replacement)。 这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一