课件：实验五DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电.ppt

实验五DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳 限制性内切酶 EcoR I Restriction Enzyme 识别序列： ------G↓AATT C ------ ------ C TTAA↓G ------ Hind III Restriction Enzyme 识别序列： ------ A↓AGCT T ------ ------ T TCGA↓A ------ 每一种限制性内切酶都有特定的反应条件 pH范围：7.5~8.0 缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷） NaCl、MgCl2、 巯基乙醇 温度：37℃ 琼脂糖凝胶电泳 是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸的方法。 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固,会形成良好的电泳介质。 电 泳 在电场的作用下，在某种支持介质上，将一个混合物分离成若干条区带的过程。 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2 试 剂 TBE电泳缓冲液 45mmol/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH 8.0 加样缓冲液 0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp) 0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色，2000bp） 40%蔗糖 EB（溴化乙锭）染色液（有毒） 0.5ug /ml，用水配制 溴化乙锭(ethidium bromide，EB) 是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 电泳结束后，将凝胶浸入 0.5ug/ml的EB溶液中染色10min。在紫外光照射下可见核酸电泳带，DNA量一般5ng。 操作步骤 酶切反应 反应体系 λ－DNA 5ul 10 x Buffer 2ul Hind III 3ul H2O 10ul Total 20ul 混匀，37度保温30分钟 制 胶 用电极缓冲液（ 0.5×TBE）配制0.7% 的琼脂糖胶20mL 0.14g琼脂糖，20mL 0.5×TBE 微波炉加热至沸腾，确定琼脂糖完全溶解 冷却至60℃左右 准备好梳子和胶槽，倒入琼脂糖溶液，冷却凝固 点 样 Sample 1自提DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 2自提DNA酶切液20ul+4ul Loading Dye Sample 3λ-DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 4λ-DNA 酶切液20ul+4ul Loading Dye 点样： Sample 1和3各7ul Sample 2和4各10ul 电 泳 接通电源，150v电泳0.5小时 染色和观察 切断电源，取出胶模，将凝胶放入EB染色液中，染色10分钟 取出凝胶，紫外灯下观察DNA电泳带型 警告 EB诱变 染色和观察时一定要带手套！ 1 2 3 4 ←RNA 提 示 1 自提DNA 2 自提DNA / Hind III 3 λ-DNA / Hind III 4 λ-DNA 结果记录与分析 绘制电泳图谱 λ-DNA / Hind III Marker λ-DNA/Hind III Marker 用Hind III彻底降解λ-DNA 贮藏缓冲液： 10mmol/L Tris-HCl (pH7.5), 10mol/L NaCl, 1mol/L EDTA λ-DNA / Hind III Markers片段大小（bp）和电泳带型示意图 点样孔 23130 9416 6557