课件：《蔗糖酶理论讲授》PPT课件.ppt

* 3.按比例配好分离胶,用移液枪快速加入，距梳齿下缘约1cm，之后加少许蒸馏水，静置直到胶与水层间出现清晰界面。 ※ 加速剂TEMED要在注胶前加入，否则凝结无法注胶。 ※ 注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。 ※ 水封的目的是为了使分离胶胶面平整，并排除气泡。 ※ 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 4. 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶，连续平稳加 入浓缩胶至短玻璃板上缘0.5cm处，迅速插入样梳,静置直到胶凝好。 ※ 样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。 实验过程 * 5. 在上槽内加入电极缓冲液，拔出样梳。 ※ 要使锯齿孔内的气泡全部排出，保证电流通畅。 6.用移液枪距槽底三分之一处加样。加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。 ※ 进样要缓慢，不要使样品漂出泳道外面。 ※ 移液枪不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。 ※ 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样。 实验过程 * 7. 电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。 8. 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，将上样槽的电极缓冲液倒入指定容器，取下电泳胶玻璃板，用楔形工具小心将玻璃板撬开，将凝胶板和溴酚蓝染料区带中心做好标记。切除浓缩胶并冲洗后放入大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。 9. 脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不同纯化过程对杂蛋白去除情况。 实验过程 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析 主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求 * * * * 三、实验步骤及原理 1、蔗糖酶的提取 2、蔗糖酶的纯化 3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定 4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定 5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响 6、蔗糖酶酶促反应动力学研究 7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 * 1、蔗糖酶的提取 (细胞破壁) 自溶法破壁（本实验） 干酵母粉 溶于蒸馏水 乙酸钠 乙酸乙酯 35℃恒温 搅拌40分钟 35℃恒温过夜 补加蒸馏水 搅拌均匀，成糊状 离心 弃沉淀及脂层 E1 记录生产厂家和批号 用硫酸纸封严（过夜） * E1 用稀 HAC 调 pH至4.5 乙醇分级 (32%乙醇饱和度)Ι 离心，取上清 乙醇分级 (47.5%乙醇饱和度) Ⅱ 离心，取沉淀 透析 磷酸缓冲液5mmol/L pH6.0 过夜 离心，取上清 E2 E2 E3 DEAE-52 离子交换层析 E3 E4 Sephadex-G100 凝胶层析 2、蔗糖酶的纯化 * 1. 酶的蛋白属性； 2. 调节酶溶解度的方法； 有机溶剂分级沉淀 3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法； 透析、凝胶层析 4. 根据酶分子电荷性质的分离方法； 离子交换层析 5. 根据酶分子专一性结合的方法; 酶的纯化方法 * 2. 调节酶溶解度的方法； 酶的纯化方法 （1）改变离子强度； 盐溶 / 盐析 硫酸铵分级沉淀（反抽提法） （2）改变pH或温度； （3）改变介电常数； 有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。 * 有机溶剂分级沉淀操作条件的控制 溶剂选择 常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。 温度 使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。 样品浓度的控制 一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5%-2% 为好。 * 3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法； 酶的纯化方法 （1）离心分离； （2）透析、超滤； （3）凝胶层析 （gel chromatography） 凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用