霍山石斛分子鉴定技术规程.docVIP

PAGE \* MERGEFORMAT 5 ICSB备案号： ICS B 备案号： DB DB DB/T ××××—××××安徽省地方标准 DB/T ××××—×××× 安徽省地方标准 霍山石斛分子鉴定技术规程 The technical specifications for identification of Dendrobium huoshanense (征求意见稿) ××××-×× ××××-××-××发布 安徽省质量技术监督局 发布 ××××-××-××实施 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。 本标准由皖西学院提出。 本标准由安徽省林业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：皖西学院 本标准主要起草人：赵群、韩邦兴、陈存武、陈乃富、戴军、宋向文、姚厚军、陈乃东、孙传伯、张莉。 霍山石斛分子鉴定技术规程 范围 本标准规定了利用特异性PCR和测序法进行霍山石斛物种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。 本标准适用于霍山石斛特异性PCR和测序法分子数据的采集和物种鉴定。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方，研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 《中华人民共和国药典》2015版 一部 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 特异性引物 (specific primer) 由人工合成，特异性、稳定性、重复性等综合特性好，用于特异性PCR和测序法鉴定必须选用的一对引物。 鉴别引物（identification primer） 由人工合成，稳定性、重复性等综合特性好，用于特异性PCR和测序法鉴定必须选用的一对引物。 通用引物（universal primer） 由人工合成，稳定性、重复性等综合特性好，用于特异性PCR和测序法鉴定必须选用的一对引物。 参照物种（reference samples） 参照物种是指稳定性好，用特异性引物扩增片段大小已知的一个物种。参照物种用于比对待测样品特异性引物扩增片段的大小，校正不同仪器设备和不同实验室间检测数据的系统误差。参照物种以无性繁殖方式进行繁殖，专人保管。 原理 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism）是一种广泛存在的突变，是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多样性。在霍山石斛中可能会存在不同于其他物种的单核苷酸多态性位点，由此可以设计一对特异性引物，其引物的3’末端应该和正品的碱基正确配对，而与伪品的碱基错配。由于在PCR（聚合酶链反应，Polymerase chain reaction）扩增时，序列的延伸是沿着引物的5’→3’方向进行的，而Tap DNA聚合酶缺少3’→5’端外切酶的活性。因此如果引物在3’端发生错配，整个扩增就会以低于正常3’端配对引物的效率延伸，所以在一定的PCR循环数的条件下，效率较高的和正品正确配对的引物扩增的产物量多，通过电泳能检测出目的条带；而和伪品错配的引物则扩增出的产物量很少而在一定的PCR循环数完成后，通过电泳检测不到目的条带，从而达到对正品和伪品的鉴别。通过以上特异性引物无法区分霍山石斛和细茎石斛，也即该2种石斛用以上特异性引物均能检测出目的条带。在此情况下，可找出另一个存在于该2种石斛之间的单核苷酸多态性位点，在该位点的上下游找到以上2种石斛的保守区段，进而设计一对用于鉴别2种石斛的引物。这对鉴别引物在霍山石斛和细茎石斛的对应区域均可扩增出一段相同长度的DNA片段，并且该片段包括以上单核苷酸多态性位点。其中，由霍山石斛扩增出的该DNA片段在该单核苷酸多态性位点上为霍山石斛的特异性碱基，而由细茎石斛扩增出的该DNA片段在该单核苷酸多态性位点上为细茎石斛的特异性碱基。通过对待检石斛用该鉴别引物对所扩增的DNA片段进行测序，如果在测序产物中该单核苷酸多态性位点上为霍山石斛的特异性碱基，则可判定待检石斛为霍山石斛，反之则不是霍山石斛。因此，根据单核酸多态性位点，利用PCR扩增、电泳技术和测序技术可以鉴定霍山石斛。 仪器设备及试剂 仪器设备及试剂见附录A。 溶液配制 溶液配制方法见附录B。 引物 引物相关信息见附录C。其中，附录C中的通用引物和特异性引物均来自于专利201610846153.7（见附录D） 参照物种及其使用 参照物种为正品霍山石斛。 在进行单核苷酸多态性位点检测的特异性PCR扩增检测时，应同时包括相应的参照物种正品霍山石斛的PCR扩增产物。 操作程序 参照物种为正品霍山石斛。 样品准备 9.1.1 按照《中华人民共和国药典》2015版的规定进行样品的