红色荧光蛋白的表达.docVIP

红色荧光蛋白的表达 闫艺 2013141241115 卫静丽 2013141241105 转化连接酶切回收酶切回收质粒提取质粒提取BL-21（pET-28a-RFP）BL-21重组质粒（pET-28a-RFP）插入片段载体片段质粒pDsRed-N1质粒pET-28aE.coliDH5α（pET-28a）E.coliDH5α 转化 连接 酶切回收 酶切回收 质粒提取 质粒提取 BL-21（pET-28a-RFP） BL-21 重组质粒（pET-28a-RFP） 插入片段 载体片段 质粒pDsRed-N1 质粒pET-28a E.coli DH5α（pET-28a） E.coli DH5α（pDsRed-N1） 菌落 菌落PCR鉴定 酶切鉴定 IPTG IPTG诱导 目的荧光蛋白基因表达 目的荧光蛋白基因表达 具体操作可分为四个阶段： 质粒DNA的提取及检测 DNA的限制性内切酶酶切及连接重组 重组质粒扩增 菌落PCR鉴定阳性克隆及诱导表达 质粒DNA的提取及检测 1.1菌种接种 根据所选择的荧光蛋白基因的菌种进行接种： DH5α-pDsRed1-N1 （红色）卡那霉素抗性 DH5α-pET- 28a （表达载体）卡那霉素抗性 接入LB液体培养基6ml+12μl (20mg/ml)kana37℃培养过夜 1.2碱裂解法提取质粒 1）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm,2min，弃上清液。 2）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。 3）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min。 4）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min。 10000rpm， 5 min，取上清液于另一干净的离心管中。 5）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm,10 min，将上清液转移至新的离心管中。 加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm,2min ,取上清液于新离心管中 6)向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀， -200C放置30min。 7)12000rpm,5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8)加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min。 9)加30μL ddH2O ，-20℃保存备用。 1.3DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.3.1琼脂糖凝胶板的制备 1)称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。 2)待胶液冷却到65℃（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子 ）内 。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。 1.3.2、加样 胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL Loading Buffer（ 6× ）混匀，加入胶板的样品小槽内。 1.3.3电泳 将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。 1.3.4观察和拍照 将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。 DNA的限制性内切酶酶切及连接重组 2.1DNA限制性内切酶酶切 2.1.1分别取两支0.2mlEP管做上记号：如① ② 2.1.2两个EP管中分别配置下列的30 μL体系： ①EP管 ②EP管 BSA 3?μL BSA 3?μL 10×buffer 3???μL 10×buffer 3???μL NotⅠ 2μL NotⅠ 2μL Bam?HⅠ 2μL Bam?HⅠ 2μL pET-28a 20?μL pEGFP-N3 20??μL 2.1.3将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱370C酶切3h。 2.1.4取5μL ① ② EP管的酶切反应液，同时取5μL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果。 2.1.5按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段 2.2DNA的连接重组 2.2.1在EP管中分别配置下列的体系： 0.2ml?EP管 10×buffer 2???μL 酶切后的pET-28a X???μL 酶切后的EGFP Y???μL T4DNA连接酶（考虑连接效率） 2???μL X ： Y = 1 : 3～10，用水补足20 μL。 2.2.2 EP管中液体混匀后瞬