应用非衍生化液相串联质谱法筛查遗传代谢病高危患儿380例初步研究.docxVIP

应用非衍生化液相串联质谱法筛查遗传代谢病高危患儿380例初步研究 【摘要】目的应用液相串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)技术对380例遗传代谢病(IEM)高 危儿童进行筛查，初步了解我国IEM的发病种类和阳性率， 为其有效防治提供科学依据。方法采集380例临床疑似遗传 性代谢病高危儿童滤纸血片，用非衍生化法进行前处理后， 采用安捷伦6460串联质谱仪分析其氨基酸和酰基肉碱浓度。 结果发现阳性患儿31例，其中氨基酸代谢病18例(58. 1%), 脂肪酸代谢疾病8例(25. 8%),有机酸血症5例(16. 1%)0 结论液相串联质谱可以快速检测血滤纸片中的氨基酸及酰 基肉碱浓度，是筛查IEM的有效工具。 【关键词】非衍生化液相；串联质谱法；遗传代谢病 遗传性代谢病或先天性代谢缺陷病(inborn errors of metabolism, IEM)是参与体内代谢的某种酶、运载蛋白、 膜或受体等编码基因发生突变，使其编码产物功能不良而引 发代谢失常的一类疾病［1］。它多为单基因遗传病，由 Archibald E. Garrod最先提出这一概念，包括代谢大分子类 疾病：溶酶体贮积症、线粒体病等和代谢小分子类疾病：氨 基酸、有机酸、脂肪酸等。国外已经开始全面普及遗传代谢 病筛查，发达国家从上世纪90年代开始大面积普及液相串 联质谱技术用于新生儿筛查，应用该技术可以通过一次实验 同时检测氨基酸、有机酸及脂肪酸等多种疾病［2］。本研究 利用非衍生化串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS) 法对380例疑似遗传性代谢病高危儿童进行检测，了解遗传 代谢病的阳性率，为我国新生儿筛查项目的扩展提供参考。 1资料与方法 1. 1研究对象2012年6月至2013年9月河南省郑州市 儿童医院就诊的临床疑似先天性遗传代谢性疾病高危患儿 380例，其中男176例，女204例。年龄为生后20h至8岁， 其中新生儿期146例，婴儿期150例，幼儿期40例，儿童 期44例。 1.2标本收集与保存使用一次性采血针刺足跟或手指， 深度小于3mm,将血滴于Scheicher and Schuell 903滤纸 样本卡，血斑正反面一致，室温下自然晾干呈深褐色，放于 封口塑料袋内，保存于2-8°C冰箱中待检。 1.3试剂和仪器甲醇、乙睛、甲酸胺、甲酸均为高效液 相色谱级别，购自Sigma公司。96孔聚丙烯锥形板，96孔 过滤板，同位素内标及质控购自PE公司。氨基酸内标11种: 2H4-丙氨酸，2H4, 13C-精氨酸，2H2-瓜氨酸，15N, 2-13C- 甘氨酸，2H3-亮氨酸，2H3-蛋氨酸，2H6-鸟氨酸，13C6-苯 丙氨酸，13C5-脯氨酸，13C6-酪氨酸，2H8-纟颉氨酸。酰基肉 碱内标13种：2H9-游离肉碱，2H3-乙酰肉碱，2H3-丙酰肉 碱,2H3-丁酰肉碱，2H9-异戊酰肉碱，2H6-戊二酰肉碱，2H3- 己酰肉碱，2H3-辛酰肉碱，2H3-癸酰肉碱，2H3-十二酰肉碱, 2H3-十四酰肉碱，2H3-十六酰肉碱，2H3-十八酰肉碱。上述 内标在实验前用甲醇稀释成工作液备用。仪器：美国安捷仑 公司高效液相色谱仪(Agilent 1600)及6460Triple Quad LC/MS型串联质谱仪。 1.4测定方法用打孔器将滤纸片打出直径3mm的圆形滤 纸血片，置于96孔过滤板中，每次实验加入高低两个质控 及一个空白，每孔加入工作液100 uL,以封板膜密封，放置 于恒温震荡仪以700转/分震荡45min,然后提取75 ? L上清 液加入另一个96孔聚丙烯锥形板中，铝箔包裹，即上样检 测。 1.5仪器设置高效液相色谱仪的流动相采用乙睛和纯 水，自动进样器每次进样2uL,每次测定采用多反应监测方 式进行检测。一个样品测试约需7min。 1.6数据分析质谱原始数据的定量分析采用自带软件 Mass Hunter B. 05. 00进行分析，根据氨基酸和酰基肉碱同 位素内标的离子峰强度，计算出所测样品中氨基酸和酰基肉 碱的浓度，并同时计算出比值。 2结果 检测380份临床疑似遗传性代谢病高危儿童血片，诊断 遗传代谢病9种31例，检出率为8.2%O 31例患儿中氨基酸 代谢病18例（58. 1%）,有机酸血症5例（16. 1%）,脂肪酸 代谢疾病8例（25. 8%）o其中氨基酸代谢病18例分别为苯 丙酮尿症（PKU） 8例，枫糖尿病（MUSD） 3例，高甲硫氨酸 血症4例，同型胱氨酸尿症1例，精氨酸血症2例；有机酸 血症5例分别为：甲基丙二酸血症（MMA）或丙酸血症（PA） 4例，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（MCAD） 1例；脂肪酸 代谢疾病8例包括肉碱转运障碍（CTD）6例和异戊酸血症（