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微生物多样性的调查与观察 生命科学学院 摘要：微生物在自然界是分布最广、种类最多的一类生物物种，因此对微生物 多样性的调查与观察有利于我们更好的了解认识我们身边的微生物世界。微生 物的形态特征包括个体形态与群体形态，个体形态主要通过显微镜以及染色技 术辨别其形态构造，而群体形态则是通过单个微生物细胞在固体培养基上经生 长繁殖后所形成的菌落（子细胞集合）来认识，菌落形态特征包括大小、颜色、 边缘、质地、表面形貌、湿润或干燥、光滑或皱褶、是否隆起，是否产生色素、 同心圆等。本次实验通过对取样、提纯、培养、染色（革兰氏染色）、计数 （血球计数板）、离心以及显微镜的使用等基本实验操作的学习，锻炼了实践 操作能力；通过对细菌，放线菌，霉菌，酵母菌，噬菌体的观察，使我们初步 接触了原核生物界，真核生物界以及病毒界，从而巩固了理论知识。 关键词：微生物，细菌，染色，观察 一、 实验目的及意义 1 ．1 环境微生物采集与观察 ①了解环境与微生物的关系及其多样性； ②学习环境微生物（土壤、水体、人体等）采样的基本方法； ③初步掌握观察微生物的实验方法； ④了解光学显微镜显微观察的基本操作和油镜头的使用方法； ⑤了解并熟悉微生物的稀释涂布分离方法与技术； ⑥树立严格的无菌意识和掌握正确的无菌操作方法。 1 ．2 不同微生物类群菌落的比较及细菌多样性观察与鉴定 ①学习观察细菌、放线菌以及霉菌的群体形态及培养特征； ②了解革兰氏染色原理，掌握革兰氏染色技术； ③熟悉细菌芽孢和荚膜的染色方法； ④初步掌握平板菌落转接平板及固体斜面的菌种纯化方法; ⑤初步学习平板菌落计数以及活菌检测的方法。 1 ．3 放线菌与真菌的显微形态特征观察以及酵母细胞的显微测微和直接计数 ①掌握观察放线菌和丝状真菌以及酵母菌显微结构的基本方法； ②了解上述三类微生物的群落特征与细胞结构上的区别； ③掌握测定微生物细胞大小的测微技术； ④掌握对单细胞微生物进行显微直接计数的方法。 1 ．4 污水中大肠杆菌噬菌体的分离、纯化与观察 ①了解从环境污水中分离噬菌体的普通原理； ②熟悉并掌握噬菌体的扩增、培养与检测的实验方法； ③学习和掌握噬菌斑效价的测定方法。 二、 实验材料和准备 2.2.1 环境微生物的采集与稀释 2.2.1.1 样品的采集： 空气中微生物采集：牛肉膏蛋白胨平板和马铃薯培养基，打开皿盖在空气中暴露 5min 使其与空气中微生物充分接触后盖上皿盖（室外和室内各 一个）。 土壤微生物采集：于南京师范大学植物园用土壤采样器进行五点对角取样，垂直取 15 cm 深度的土壤，取最前端 1 到 2cm 的土壤，将土样装入灭菌的信 封中封好，混匀。将土样带回实验室进行处理，称取 1g 土壤放入 含 9ml 无菌水的三角瓶中（内含玻璃珠数粒），振荡分散。 水体微生物采集：用水样采样器分别取采月湖污水和水库水约 500ml。 2.2.1.2 样品稀释 ： 土壤微生物样品的稀释： 称取1克土壤放入含9ml无菌水的三角瓶（内含玻璃珠数粒）， 混匀后用加样枪和Tips在离心管中进行10的倍比稀释成10-4,10-5,的梯度样品。 水体微生物样品的稀释：将污水和洁净水, 分别稀释成10-1,10-2,10-3,10-4等系列。 倍比稀释操作为0.1ml 样液＋0.9ml无菌水。 2.2.2 口腔微生物的采集 取样：取一片载玻片，滴一小滴水，用无菌牙签在牙缝内反复擦拭几遍，然后将牙签 打散均匀涂布于载玻片上的水滴中。 2.2.3 污水样品的采集 1) 于正式上课前24小时培养敏感细菌：经活化的大肠杆菌固体斜面一支，接种一环至 20ml牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，摇瓶培养至对数期（12小时左右）。 2) 于正式上课前12小时采集护校河污水100mL。 3) 用无菌移液管取上述敏感细菌培养液5ml于盛有50ml 3×牛肉膏蛋白胨液体培养液 的三角瓶内，37℃培养5小时后加入100ml环境污水样品，37℃继续摇瓶培养12小 时以增殖噬菌体。 2.2.3 实验仪器及用具 加样枪、离心管、酒精灯、显微镜/载玻片、接种环、解剖针、解剖刀、镜台测微 尺、目镜测微尺、血球计数板、细菌过滤器，普通离心机； 革兰氏染色液一套、黑色素、碱性品红染液;插片培