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新生大鼠肺泡II型上皮细胞原代分离、培养和鉴定 摘要：目的 探究新生大鼠肺泡II型上皮细胞 (alveolar typeIIepithelial cell, AT-II )的原代分离、 培养及鉴定方法，建立体外细胞模型。方法取SPF级新生 Wistar大鼠肺脏，采用胰蛋白酶联合胶原酶消化法分离 AT- II ,免疫黏附法纯化细胞，体外培养并进行传代研究， 透射电镜鉴定细胞。结果AT-II细胞原代培养和传代研究成 功，细胞生长状态良好。电镜观察到板层小体。结论采用 改良方法获得的AT-II细胞符合体外实验要求，第24?72h 内处于最佳生长状态，是进行实验研究的良好时间段。 关键词：新生大鼠；肺泡II型上皮细胞；原代培养；鉴 定 肺泡 II 型上皮细胞(alveolar type II epithelial cells, AT-II)是肺泡上皮细胞的干细胞，又被称为”颗粒 性肺泡细胞”和”分泌细胞”，是一种多功能细胞。AT-II 除了能增殖成新的AT-II细胞，还可分化为肺泡I型上皮细 胞(alveolar type I epithelial cell, AT- I ) [1]。AT- I 和AT- II共同组成肺泡上皮屏障。AT- II约占肺泡细胞群的 60%[2],细胞形态为多角形、立方形或圆形，细胞质内有大 量反差明显的细小颗粒。应用AT-II开展相应研究，对认识 肺的正常生理功能和多种肺部疾病有重要意义。 原代培养、分离、纯化可以排除其他肺组织细胞对AT-II 的影响［3］。有文献报道AT-II易变性、易分化，表型丧失快, 基本不能传代［2］。亦有文献报道它具有无限增殖的潜能 ［4］。本次实验在借鉴他人实验方法的基础上进行了简化改 良，顺利进行了 AT-II的原代培养、分离、纯化与鉴定，并 进行传代研究。 1资料与方法 1. 1实验动物SPF级新生24h内Wistar大鼠，由甘肃 中医学院科研试验中心SPF级实验室提供。 1.2实验试剂DMEM培养基、PBS缓冲液、胎牛血清、0. 2% 胶原酶、0.5%胰蛋白酶、10%水合氯醛、75%乙醇、IgG溶液、 100U青霉素、100U链霉素、5%戊二醛。 1. 3方法 1新生大鼠AT-II细胞的原代分离取SPF级新生 24h内Wistar大鼠，借鉴张秋月［5］等的方法加以改良进行 实验操作。10%水合氯醛麻醉乳鼠(0.3ml/100g),放入75% 乙醇消毒Imino在超净台内进行无菌操作，取出肺组织，将 其置于盛有5ml预冷PBS的无菌培养皿中，去除气管、支气 管和小血管等组织，吸弃液体和杂质，再用无菌PBS反复冲 洗直至液体澄清，吸弃液体后用无菌手术剪将其剪成lmm3 碎块。将其转移至10ml无菌离心管中，加入0.2%胶原酶6ml, 置于37￡恒温震荡水浴箱内消化lh,再加入4ml0.5%胰蛋白 酶消化30min, 4°C条件1500r/min离心5min,弃上清。加 10%胎牛血清的DMEM培养基5ml终止消化，吹打均匀，200 目金属滤网过滤细胞悬液，将细胞浓度调至（2?3） X106 个/ml。 2 AT-II细胞的纯化 借鉴Dobbs[6]等采用的IgG吸 附纯化法对AT-II细胞进行纯化。将调整好浓度的AT-II细 胞悬液，转移至事先制备好的用大鼠IgG包被的无菌培养皿 中，置于37°C、5%C02培养箱孵育90?120min,移出未黏附 的细胞，4°C条件800r/min离心lOmin,弃上清[6-7] o 1. 3. 3细胞培养 取细胞沉淀，用DMEM完全培养基（含 10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）重悬细胞 于一次性无菌培养瓶中，调整细胞浓度为（2?3） X106个 /ml,置于37°C, 5%C02孵箱内。培养24h后，移除未贴壁 细胞，无菌PBS洗2次，用完全培养基进行细胞换液。在倒 置相差显微镜下观察不同培养时间后细胞的贴壁生长情况 和形态特征变化。 4细胞鉴定AT-II的鉴定方法有多种，如透射电镜、 免疫组织化学、免疫荧光染色、碱性磷酸酶（AKP）染色鉴 定等。电镜下可清楚观察到AT-II胞质内的特征性板层小体 （嗜餓小体），是鉴定AT-II的金标准[1],故釆用该法进行 细胞鉴定。用0.25%胰酶消化细胞，胎牛血清终止消化，稍 作吹打后lOOOr离心7min,弃上清，加0.5ml 5%戊二醛固 定。制备为电镜细胞标本，于透射电镜下观察。 2结果 2.1细胞生长状态实验结果表明：新生大鼠AT-II细胞 原代培养24?36h大量贴壁，呈岛状生长；36?48h,细胞 平展呈多边形或圆形，相互连接成细胞单层，胞质内有大量 反差明显的细小颗粒，细胞核明显；48?72h,细胞大量增 殖，是生长最旺盛、活力最强的时期；第4?5d,细