发酵工程在现代生物技术中的应用.pptVIP

物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。 生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。 第二节 动、植物细胞大规模培养 动植物细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 一、细胞融合技术 细胞融合技术（cell fusion technology)，是指两个或更多个亲本细胞经酶法出去细胞壁得到两个球状原生质球，通过生物法、化学法或物理法等诱导融合形成单个细胞，获得新的重组子的过程。 理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新 的核外遗传系统。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。 生物种类 细胞来源 成功年代 烟草两个种间 苷蓝——青菜 大豆——马唐草 矮牵牛——龙面花 大麦——花生 大麦——大豆 小麦——矮牵牛 油菜——大豆 玉米——大豆 大豆——野豌豆 大麦——蚕豆 大豆——草香木犀 酵母菌——鸡 大豆——烟草 大豆——秋水仙 人——胡萝卜 番茄——马铃薯 人——小鼠 叶——叶 叶——根 愈伤组织——叶 叶——花瓣 种子——种子 叶——悬浮细胞 叶——花瓣 叶——悬浮细胞 叶——悬浮细胞 悬浮细胞——悬浮细胞 叶——根 悬浮细胞——叶 原生质体——血红细胞 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 腹水癌细胞——原生质体 叶——根尖 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 几种细胞融合成功的例子 细胞的融合过程 植物细胞融合过程 人造小鼠培育过程示意图 （一）原生质体的制备 影响原生质体制备的因素： 1、亲本的选择及预处理 微生物细胞——取对数期细胞，培养基中加入细胞壁合成抑制剂，可以增加菌体对脱壁酶的敏感性 植物细胞——一般选择活跃生长器官和组织细胞，由此制得的原生质体生活力较强，再生分化比例较高。常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶 2、除壁酶的选择 细菌放线菌用溶菌酶处理 酵母菌用蜗牛酶处理 霉菌用几丁质酶和纤维素酶配合 植物细胞一般用混合酶 3、酶浓度 酶浓度增加，原生质体的形成率也增大，酶浓度过低不利于原生质体形成，酶浓度过高则导致原生质体再生率的降低 4、酶解温度 20~40℃ 5、酶解时间 酶解时间过长，原生质体再生率降低 6、渗透压稳定性 原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压下才能维持 （二）原生质体融合 融合是把两个亲本原生质体混合在一起，通过诱导融合作用使原生质体发生融合。 1、生物学法 主要用于动物细胞融合 该法由于病毒的致病性和寄生性，制备比较困难，诱导产生的细胞融合率比较低，重复性不高，近年 不多用 用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。 应用最广泛的化学融合剂聚乙二醇(PEG) 聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。 通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50％PEG溶液能产生 最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。 2、化学融合法 聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程 3、物理法 常用的物理法为电击法，当细胞处于电场中，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。 电融合法的优点： 融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程； 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。 电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可