14[安徽医大精品课程]生物化学第十四章 基因重组和基因工程教材编辑.ppt

(插入失活法) 抗药性标记选择 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标志补救 α 互补的检测 标志补救 原位杂交 Southern印迹 （四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 等等 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 载体的选择标准 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 生物安全 1. 质粒 (plasmid) 特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） 2. 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 含有的lacZ基因编码了β半乳糖苷酶的α片段（N端），插入外源DNA后，α片段不能正常合成 3. 柯斯质粒(cosmid) 一种人工构建的克隆载体，包含了λ噬菌体的cos基因。柯斯质粒能被包装到λ噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携带入宿主细菌的DNA片段（超过45kb）要比质粒载体携带的要大 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 其他 二、重组DNA技术基本原理 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体菌 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 2.基因组DNA文库 (genomic DNA library) 3. cDNA文库 (cDNA library) 4. 聚合酶链反应( PCR ) * 化学合成法获取目的基因 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 一般用于小分子基因的合成 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 * 从基因组DNA文库获取目的基因 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 基因组DNA文库（genomic DNA library） 将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为G文库 cDNA文库(cDNA library)： 以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。 C-文库具有组织细胞特异性。 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。 利用PCR合成： （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 （二）克隆载体的选择和构建 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体