人体外周血淋巴细胞G带分带及姐妹染色单体色差分析.docVIP

人体外周血淋巴细胞G带分带及姐妹染色单体色差分析 王伊丹 （中山大学生命科学学院生物技术与应用基地班 广州 510275） [摘要]染色体是细胞分裂过程中出现的一种常见结构，在人类染色体研究中外周血是制备染色体标本的重要材料之一而只有获得染色体标本才能进行核型分析。G带染色技术是目前应用最广泛的技术，形成了染色体蛋白质的差异从而有利于染色体研究的进展，姐妹染色单体应用单体区分染色法（sister chromatid differential staining, SCD）进行染色研究并统计姐妹染色单体互换（sister chromatid exchange,SCE），SCE可以作为哺乳动物突变形成的指标，本实验中30个人外周血淋巴细胞姐妹染色单体互换的平均值为1.57。 [关键词]染色体；人体外周血淋巴细胞；G带染色技术；姐妹染色单体区分染色法 染色体是细胞分裂过程中出现的一种可见结构，是基因的载体。在人类染色体研究中外周血是制备染色体标本的重要材料之一。染色体是由DNA，组蛋白，非组蛋白组成。DNA链上有A-T丰富区及C-G丰富区，用Giemsa染色，A-T较C-G更易染色。G带染色法是用Giemsa染色，是目前应用最广泛的染色体分带技术之一，染色体标本放到37℃胰酶中是G带显示的一种预处理方式，它可以从染色体上抽取蛋白质特定的成分，从而经Giemsa染色后获得良好一致的分带类型[1]。在DNA复制的过程中，核苷类似物5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）可以代替胸腺嘧啶核苷（T）掺入到新复制的DNA链中，哺乳动物细胞在含BrdU的培养液中培养，第二次分裂后出现双股均含BrdU的DNA，由于双股均含BrdU的DNA分子构型有变化，Giemsa染液染色时就可清楚看到双股都含BrdU的DNA链所组成的单体着色浅，而仅一条链含BrdU的单体着色深。同时统计30个细胞的SCE的数值。目前SCE被列为检测致突变物，致癌物的常规指标之一。 1.实验材料 1.1人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备 实验仪器及试剂有：超净工作台，恒温培养箱，恒温水浴箱，天平，角转离心机，显微镜，离心管，2ml注射器，吸管，量筒，培养瓶，烧杯，试剂瓶，酒精灯，载玻片，切片盒；RPMI-1640培养基，肝素（称取该粉末160mg，用40ml生理盐水溶解，即500单位/ml，55.2kPa灭菌15min），秋水仙素（称取秋水仙素2mg，用50ml生理盐水溶解，6号细菌漏斗过滤，4℃冰箱保存。使用时终浓度为0.4-0.8μg/ml），PHA，双抗（青霉素取4ml生理盐水稀释40万单位，链霉素取10ml生理盐水稀释100万单位），小牛血清，Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），1/15mol/L磷酸缓冲液（PH7.4），Giemsa原液，人体外周血。 1.2人染色体G带分带 实验仪器有恒温培养箱，恒温水浴锅，显微镜，染色缸，镊子，烧杯，擦镜纸以及吸水纸。实验中用到的试剂为PH6.8磷酸缓冲溶液，PH7.0 ICN溶液，PH7.0 GKN溶液，0.25%胰蛋白酶溶液，Giemsa原液。实验材料为人外周血淋巴细胞染色体标本。 1.3姐妹染色单体色差分析 实验的仪器为超净工作台，恒温培养箱，恒温水浴紫外照射仪，天平，离心机，2ml注射器，习惯，量筒，培养瓶，烧杯，酒精灯，载玻片，擦镜纸，玻片架。试剂为培养液（同外周血淋巴细胞培养液），BrdU液（用无菌青霉素瓶于分析天平称取BrdU2mg，然后再无菌室内加入无菌生理盐水4ml，即500ug/ml，用黑布避光，置冰箱中保存，最好现配现用），2×SSC溶液（0.3mol/L氯化钠，0.03mol/L枸橼酸钠），PH6.8磷酸缓冲液，40μg/ml秋水仙素溶液，1mol/LNa2HPO4溶液（用稀盐酸调节PH至8.0），席夫（Schiff）试剂，亚硫酸水漂洗液，3.5mol/L盐酸，45%醋酸。实验材料为人外周血玻片标本。 2.实验流程 2.1 人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备 实验时先配置培养基，用RPMI-1640粉末约800ml三蒸水溶解，再加入其它成分混匀，定容至1000ml，用5%NaHCO3调PH至7.2，用过滤方式灭菌，最后分装至预先高压消毒好的培养瓶中，每小瓶装5ml，塞进瓶塞，胶布封口备用。培养基完成后，进行采血工作，用2ml灭菌注射器吸取肝素湿润管壁，然后用碘酒和乙醇消毒皮肤，从肘静脉才学1-2ml，在酒精灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内（内含有生长培养基5ml）接种全血0.3ml左右，轻轻摇匀，将其分为3瓶分装的以及两瓶分装的。置37℃培养箱中培养72h，终止培养前3.5h用注射器向培养物中加入秋水仙素，最终浓度为0.4-0。8μg/ml。将72h并经秋水仙素处理的培养瓶从温箱取出，3瓶的每小瓶去