05—酶工程制药课件.pptx

第五章 酶工程制药;第一节 概述 第二节 酶的分离纯化 第三节 酶和细胞的固定化 第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器 第五节 酶的人工模拟 第六节 酶的化学修饰 第七节 酶工程研究的进展;第一节 概 述;酶工程简介;酶的基础知识;6;7;现代酶工程的主要内容;酶的来源;早期酶的生产多以动植物为主要原料;目前工业生产一般都以微生物为主要来源;酶的生产菌;生产菌的来源;14;15;16;17;;;20;;22;24;25;26;27;28;;第二节 酶的分离纯化;31;32;33;34;35;36;第三节 酶和细胞的固定化;38;39;40;41;（一）固定化酶的制备;2、固定化酶的特点;固定化酶缺点;3、酶和细胞固定化方法;酶和细胞的固定化方法;酶和细胞固定化模式;（1）载体结合法;49;50;载体结合法 注意事项;（2）交联法;53;交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。 交联法反应条件剧烈，固定化酶的酶活回收率低（故尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间），会引起酶活性中心结构的改变，导致酶活性降低（常加入辅助蛋白如牛血清蛋白提高固定化酶的稳定性），因此常与吸附法或包埋法联合使用。;（3）包埋法;56;57;①海藻酸钠与CaCO3（“蛋盒”模型，形成热不可逆凝胶）； ②壳聚糖（阳离子胺基）与海藻酸钠，通过正负电荷吸引，产生瞬时凝胶化作用，形成聚电解质半透膜； ③壳聚糖胺基与戊二醛基形成shiff氏碱，在胶囊表面形成一层致密的保护膜，可增加微胶囊球的强度，能有效的防止磷脂酶从微胶囊中泄漏，而提高固定化酶的活力回收。 ;;（4） 选择性热变性法;4、酶和细胞的固定化载体;5、新型的酶固定化方法;无载体固定化酶直接用交联剂交联 用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，优点如下： 催化活性高，成本低 具备较高的催化剂比表面 可加入多种酶 底物扩散受限制少 极端条件下稳定性高;（二）固定化细胞;65;66;67;68;固定化细胞的制备技术;（1）载体结合法制备技术;（2）包埋法制备技术;（3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。可以获得高密度细胞，固定化条件温和，但是机械强度差。 此外还有粘合法，截留法等 ;73;固定化方法的选择依据;（四）固定化酶（细胞）的性质与指标;（1）颗粒状：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 ;（3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可用交联等其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。 （4）管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶等酶管。 ;2、固定化酶的性质 酶经过固定化后，其催化反应体系由均相转变为非均相。由于固定化方法和所用载体的不同，固定化酶受到扩散限制、空间障碍、微环境变化和化学修饰等因素的影响，从而导致酶学性质和酶活力的变化。;（1）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。 原因主要：①酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化；②酶与底物结合时存在空间位阻效应，影响活性中心对底物的定位；③包埋法中酶被高分子物质包围，大分子物质不能透过膜，导致底物与产物扩散阻力增大。 解决办法：反应条件尽可能温和；加入抑制剂、底物或产物保护酶活性中心。 但是，由于偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程中提高了酶的稳定性，某些酶在固定化后酶活力得到提高。;（2）酶稳定性的变化：稳定性包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。 固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止其自溶，增加酶构型的牢固程度。 但是，当固定化过程影响到酶活性中心和酶的高级结构的敏感区域，也将导致酶活性降低。;a、热稳定性提高：热稳定性越高，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。 b、操作稳定性：实际应用的关键所在，通常用半衰期表示。半衰期达到1个月以上时，即具有工业应用价值。 c、贮藏稳定性：一般不能