医药基础-基因工程菌的发酵-30页.pptxVIP

第六节 基因工程菌的稳定性;基因工程菌的稳定性;基因工程菌的稳定性;基因工程菌的稳定性;基因工程菌的稳定性; 影响基因工程菌稳定性的因素 载体的选择 遗传特性 宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上 培养基 生长速率 发酵工艺 限制性基质 温度 pH 和溶氧 外源基因表达; 提高基因工程菌稳定性的策略 改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括： 将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编码基因）;培养基 一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培 养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质， 微生物的生长较在基本培养基中快。 ;比生长速率 基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。 基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和 pH 下，限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。;限制性基质 一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响;pH 和溶解氧 pH 和溶氧影响重组酵母菌的稳定性。 pH 和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌时，通常都需要???持一定的 pH 和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。;外源基因的表达 外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定 外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。 例如，吲哚丙烯酸（IAA ）是 trp 操纵子阻遏物的部分去阻遏剂，在培养大肠杆菌 MV12（pVH5）时，在培养基中加入不同量的 IAA，发现随 IAA 量的增加，pVH5 带有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表达水平有很大提高，同时比生长速率下降，培养液中 Trp－ 的比例上升。电泳分析表明 60%～70% 色氨酸合成能力丧失是由于质粒结构的变化，其余是由于质粒丢失造成。;提高基因工程菌稳定性的策略 施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高;提高基因工程菌稳定性的策略 分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问 题的发生；在获得需要的