免疫组化技术分析课件.ppt

免疫组化的作用 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 免疫组化操作步骤 一.石蜡切片制作 1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h 2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h 3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min 4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织 5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带 6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上 （洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶：防脱剂多聚赖氨酸） 7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h 二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结）三步法 1、脱蜡、水化 60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；60℃×20分钟→二甲苯2 × 10分钟 100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；100%的绝对乙醇:2×5分钟; 95% ethanol 2 minutes；95%的乙醇2分钟 80% ethanol 2 minutes； 70% ethanol 2 minutes； distilled water:5 min；蒸馏水:5分钟 PBS洗3次×3 min。 2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂）加热几分钟后，临用前加400 ul 30％H2O2。 PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间隔补足液体，防止干片 4、封闭非特异性蛋白 PBS溶液洗3次×3 min； 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 用PBS洗5次×5 min； 7、SP反应 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5 min（3～10 min），由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光）（1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。 9、复染、脱水、透明、封片 用PBS 3次×3min后，用双蒸水洗5 min； 加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗，双蒸水洗5 min，再用PBS返蓝5 min。 脱水 50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 封片：中性树胶。 结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野（400X），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析 设备 恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片机、载玻片和盖玻片、高压锅或微波炉、染色缸、显微镜、计算机图像分析系统 所用试剂 · 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2M