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免疫组化的原理及流程介绍 免疫组化原理及流程介绍 主要内容 免疫组化原理及流程介绍 二 免疫组化的原理 免疫组化原理及流程介绍 它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 免疫组化原理及流程介绍 三 免疫组化的基本流程 免疫组化原理及流程介绍 1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。 2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。 免疫组化原理及流程介绍 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 (约30℃)下10～30min。 免疫组化原理及流程介绍 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。 免疫组化原理及流程介绍 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。 免疫组化原理及流程介绍 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。 免疫组化原理及流程介绍 1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min 免疫组化原理及流程介绍 免疫组化原理及流程介绍 1) 用 PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染 20 s ），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min，再用 PBS 返蓝 5 min。 2) 脱水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 3) 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 4) 封片：中性树胶。 免疫组化原理及流程介绍 免疫组化原理及流程介绍 从表上可以看出，只有6，7实验结果有意义。1～5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用 Ab. 免疫组化原理及流程介绍 1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。 2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但又防止干片 。 免疫组化原理及流程介绍 3.以下原因可能导致片子着色不均匀： ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，立即放入新鲜的 二甲苯中； ② 水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇； ③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂； ④ 抗体孵育时，切片放倾斜； ⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。 ⑥ 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。 免疫组化原理及流程介绍 4.一抗的清洗： 免疫组化原理及流程介绍 5.PBS的PH和离子强度的使用。 免疫组化原理及流程介绍 5.拍照 免疫组化原理及流程介绍 实验分析的相关介绍 阳性对照： 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。 阴性对照： 免疫组化原理及流程介绍 受检组织含定位Ag ＋ － － ＋ 7 受检组织不含定位Ag － － － ＋ 6 受检组织非特异性染色 ＋ ＋ － ＋ 5 阴性对照不含定位Ag ＋ － － － 4 阴性对照含定位Ag － － ＋ ＋ 3 非特异性反应 ＋ ＋ ＋ ＋ 2 操作错误 － － － － 1 结论 实验 组 替